Untersuchung von Mediatoren der Leberregeneration nach Hepatektomie

Prospektive, nicht randomisierte Studie zur Untersuchung der Expression von Mediatoren der Leberregeneration nach Hepatektomie (PHLR) und zum Vergleich mit einer Gruppe ohne Hepatektomie: eine Pilotstudie

Hintergrund: Experimentelle Studien unter Verwendung von Tiermodellen nach Hepatektomie wurden verwendet, um den Mechanismus der Leberregeneration zu untersuchen. Hepatektomie für verschiedene Krankheiten und Lebendspender-Lebertransplantation bieten ein gutes menschliches Modell, um den Mechanismus der Leberregeneration in vivo zu untersuchen. Diese Studien sind für die klinische Anwendung der durch Tierversuche gewonnenen Erkenntnisse erforderlich und werden die weitere Forschung leiten, um neue Modalitäten für die Behandlung von Leberversagen, Zirrhose und Krebs zu entwickeln.

Einführung :

Die Leber ist ein lebenswichtiges Organ, das verschiedene Stoffwechsel- und Schutzfunktionen erfüllt, die für die Erhaltung des Lebens notwendig sind, und es hat ein inhärentes Potenzial zur Regeneration und Wiederherstellung des Volumens nach seiner Teilresektion. Leberregeneration nach Hepatektomie erfolgt hauptsächlich durch Proliferation reifer Hepatozyten (Fausto N 2003 & 2004); Veränderungen der portalen Hämodynamie und der Zytokine (IL-6, TNF-α) gelten als wichtigste Triggerfaktoren für diesen Prozess. (Abhshagen K. et al. 2012, Scotte M. et al. 1997) Es wird vermutet, dass eine erhöhte Abgabe von Pfortaderblut an die Restleber eine Schädigung durch Scherstress verursacht, die zur Freisetzung von Faktoren wie NO und VEGF führt, die die Regenerationskaskade aktivieren (Marabushi et al. 2004). Zytokine (IL-6 und TNF-α), NO und VEGF wirken auf Pro-HGF (inaktiver Hepatozyten-Wachstumsfaktor), um es in aktives HGF umzuwandeln, das durch Met-Rezeptoren wirkt, um STAT-3 weiter zu aktivieren, das ein Schlüsselmediator der frühen Phase von ist PHLR. (Abhshgen K. et al. 2008, Cresman DE et al. 1996, Cressman DE1997, Sudo K. et al. 2008, Borowicak M. et al. 2004, Paranjpe S. et al. 2007) Eine erhöhte Abgabe von Pfortaderblut an die Restleber erhöht auch die Verfügbarkeit von Aminosäuren pro Einheit B. Pankreashormone, aus dem Darm stammende Endotoxine und andere hepatotrophe Faktoren, können alle diese direkt wirken, um die DNA-Replikation zu aktivieren. (Bucher NL et al. 1977, Riehle KJ et al. 2011) Die Verabreichung einer Aminosäuremischung an intakte Ratten induziert eine Hepatozyten-Replikationswelle und deren Entzug blockiert PHLR. (Mead JE et al. 1990) Insulin, Glukagon und Wachstumshormon haben ebenfalls einen signifikanten Einfluss auf die Leberregeneration. (Bucher NLR 1976, Shi min luo et al. 2004, Amal ZS et al. 2011) Die Fähigkeit der Leber, sich nach ihrer Teilresektion zu regenerieren, erlaubt uns, eine Hepatektomie für Lebendspende-Lebertransplantationen, Leberneoplasmen und Gallenkrebs durchzuführen. Die Hepatektomie für diese Zustände liefert uns auch ein gutes Modell, um den in vivo-Mechanismus der Leberregeneration beim Menschen zu untersuchen. Diese Studien sind wichtig für die klinische Anwendung der Erkenntnisse, die durch experimentelle Studien an Tieren nach Hepatektomie gewonnen wurden. Diese Studien werden uns helfen, die Mediatoren verschiedener Phasen der Leberregeneration nach Hepatektomie (PHLR) zu kennen, und werden zukünftige Forschung leiten, um neue Ansätze für die Prävention und Behandlung von lebensbedrohlichen Komplikationen nach Hepatektomie wie „Small for Size Syndrom“ oder Leberversagen zu entwickeln . Diese Wege werden helfen, die In-vivo-Kontrolle der Zellproliferation zu verstehen, und könnten sich als entscheidend für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze zur Behandlung von Zirrhose und Krebs erweisen.

Nullhypothese: Die Expression von Mediatoren der Leberregeneration nach Hepatektomie (PHLR) unterscheidet sich nicht zwischen Hepatektomie (Studiengruppe) und Nicht-Hepatektomie-Gruppe (Kontrollgruppe).

Ziel: Untersuchung des Mechanismus der Leberregeneration nach Hepatektomie (PHLR) und Vergleich der Expression von PHLR-Mediatoren zwischen Hepatektomie (Studiengruppe) und einer Gruppe ohne Hepatektomie (Kontrollgruppe).

Ziele :

1. Untersuchung der Mediatoren von PHLR im menschlichen Modell.
2. Um die Expression von Mediatoren PHLR zwischen Hepatektomie (Studiengruppe) und Nicht-Hepatektomie (Kontrollgruppe) zu vergleichen.
3. Es sollten anfängliche Veränderungen von PHLR im Lebergewebe untersucht werden. Patient und Methode: Diese prospektive, nicht randomisierte Studie wird an zwei Gruppen von Patienten durchgeführt – Hepatektomie (Studie)-Gruppe und Nicht-Hepatektomie (Kontrolle)-Gruppe, und mindestens 10 aufeinanderfolgende erwachsene (18 Jahre oder älter) Patienten werden in jeder Gruppe rekrutiert gemäß den unten angegebenen Ein- und Ausschlusskriterien. Die Einwilligung nach Aufklärung wird von den Patienten in beiden Gruppen eingeholt. Peripheres (aus einer Unterarmvene) venöses Blut (6 ml) wird einen Tag vor der Operation und nach der Operation an den postoperativen Tagen 1, 3, 7, 14 (2 Wochen), 42 (6 Wochen) und 180 (6 Wochen) entnommen Monate). Ein kleiner Ast der Pfortader wird mit einem intravenösen 20-Gauge-Katheter zur Messung des Pfortaderdrucks und zur Entnahme von Pfortaderblut (6 ml) zu Beginn der Operation, aber nach dem Eintritt in das Abdomen und am Ende der Operation, aber vorher, kanüliert Verschluss des Bauches. Die Entnahme der Blutprobe aus einer peripheren Vene (Unterarmvene), die Messung des Pfortaderdrucks und die Entnahme des Pfortaderbluts werden in beiden Studiengruppen durchgeführt, aber Patienten in der Hepatektomie-(Studien-)Gruppe werden einem zusätzlichen Verfahren unterzogen, d. h. Trucut (Nadel) Biopsie aus der Restleber.

Leberbiopsieproben werden in Formalinlösung konserviert und in das Pathologielabor überführt, um anfängliche Veränderungen während PHLR und ihre möglichen Mediatoren zu erkennen, normales Lebergewebe, das in resezierten Proben vorhanden ist, dient als Selbstkontrolle. Blut aus der peripheren Vene und kleinen Ästen der Pfortader wird in einem für diesen Zweck verwendeten Standardfläschchen gesammelt und zur Analyse zum Nachweis von Mediatoren der Leberregeneration ins Labor überführt. Die Analyse der Blutprobe erfolgt nach der ELISHA-Methode. Die Messung des Pfortaderdrucks erfolgt durch Kanülierung des kleinen Astes der Pfortader (z. Gastro epiploische Vene) nach dem Eintritt in die Vene wird dieser intravenöse Katheter über einen mit physiologischer Kochsalzlösung gefüllten Verbindungsschlauch mit einem digitalen Druckaufzeichnungsgerät verbunden. Dieses digitale Druckaufzeichnungsgerät ist in jedem Anästhesiearbeitsplatz verfügbar (Fabrikat: Drager) und liefert normalerweise Messwerte in mm Hg. Die Druckaufzeichnung erfolgt vor und nach der Operation, um die Auswirkungen der Operation auf den Pfortaderdruck zu beobachten.

Einschlusskriterien: Erwachsene Patienten (ab 18 Jahren) mit bösartigen Neubildungen des Gastrointestinaltrakts, die entweder eine Teilresektion der Leber (Studiengruppe) oder eine Resektion anderer Teile des Gastrointestinaltrakts (Kontrollgruppe) erfordern und bereit sind, an der Studie teilzunehmen.

Ausschlusskriterien – Patienten, die nicht bereit sind, an der Studie teilzunehmen. Patienten mit Zuständen, die die Expression des Mediators von PHLR beeinflussen können (z. Immunsuppression, chronische Hepatitis, Zirrhose, portale Hypertonie, Schwangerschaft, Anwendung von Verhütungsmitteln), Patienten, bei denen während der Operation eine fortgeschrittene oder inoperable Erkrankung festgestellt wird, werden von der Studie ausgeschlossen und die von ihnen erhobenen Daten werden nicht in die Analyse einbezogen.

Stichprobengröße: Mindestens 10 Patienten in jeder Gruppe Design: prospektiver, nicht randomisierter Versuch Ort der Studie: Abteilung für Gastrointestinale Chirurgie, GBPH und MAMC, Neu-Delhi Dauer: 2 Jahre. Follow-up: 6 Monate Finanzierung: Die Ermittler beantragen die Finanzierung durch die Regierungsbehörden. Mediator von PHLR, der im peripheren Blut durch das ELISA-Verfahren zu analysieren ist – IL-1, IL-6, TNF-α, TNF-β, HGF (Hepatozyten-Wachstumsfaktor), GH (Wachstumshormon), Insulin und Glucagon.

Untersuchung von Leberbiopsieproben (Immunhistochemie): Mitoseindex (Ki 67), EPCAM, STAT-3, Rezeptor für HGF, VEGF, NKAM und CD133.

Statistische Methoden: Alle Daten werden in Microsoft Excel eingegeben und statistische Berechnungen werden mit SPSS-Software durchgeführt. Um die Mittelwerte der Expression verschiedener Gewebefaktoren im Lebergewebe vor und nach Hepatektomie zu vergleichen, verwenden die Forscher den gepaarten t-Test, wenn die Verteilung der Variablen normal ist, und den Wilcox-on-Vorzeichen-Rang-Test für eine Nicht-Normalverteilung. Zum Vergleich der Expression von Mediatoren der Leberregeneration im Serum von Patienten in Studien- und Kontrollgruppen verwenden die Forscher den unabhängigen t-Test für eine Normalverteilung und den Mann-Whitney-Test für eine Nicht-Normalverteilung. Um die Durchschnittswerte der Serumspiegel von Mediatoren der Leberregeneration zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach der Operation zu untersuchen, verwenden die Forscher ANOVA für eine Normalverteilung und den Friedman-Test für eine Nicht-Normalverteilung, gefolgt von einem Post-hoc-Test. Ein P-Wert von 0,5 oder darunter wird verwendet, um die Signifikanz abzuleiten.

Literaturische Rezension:

Leberregeneration nach Hepatektomie ist ein sehr komplexer und geordneter Prozess, der die Proliferation reifer Hepatozyten zur Wiederherstellung des Lebervolumens beinhaltet. Der genaue Mechanismus der Leberregeneration wurde bisher nicht aufgeklärt, aber Beweise basierend auf Tierversuchen (Ratte, Maus, Hund usw.) deuten darauf hin, dass akut Veränderungen in der portalen Hämodynamik, Zytokine, Wachstumsfaktoren (HGF, TGF, EGF), Hormone (wie GH, Insulin oder Adrenalin) sind aktiv an diesem Prozess beteiligt, der von Hunderten von Genen gesteuert wird. (Fausto N. 2012 und Michelopoulos 2010) Marabushi et al. (2004) schlugen vor, dass ein akuter Anstieg der Blutpfortadermenge an die Restleber eine Scherbelastung verursacht, die zur Produktion von Stickstoffmonoxid (NO), Aktivierung des Kalziumkanals und Freisetzung führt von VEGF; sie alle spielen eine Schlüsselrolle bei der Einleitung des Regenerationsprozesses. Bucher NL (1964) beobachtete, dass hämodynamische Veränderungen des portalen Blutflusses direkt mit dem Ausmaß der Hepatektomie zusammenhängen, der Anstieg des portalen Drucks nach 90 % Hepatektomie ist viel höher als nach 70 % Hepatektomie. Sato et al. (1997&1999) bestätigten erneut die Befunde von Bucher NL und beobachteten ebenfalls einen fortschreitenden Anstieg des Pfortaderdrucks mit fortschreitender Leberregeneration und dessen Abnahme gegen dessen Abschluss. Experimentelle Studien verschiedener Forscher wie Wang und Lautt (1998), Cantre D et al. (2008), Schoen JM et al. (2001) und Mei Y et al. (2011) bestätigten die Rolle von NO bei der Aktivierung von Faktoren, die für die Hepatozytenproliferation verantwortlich sind. VEGF, das aus sinusoidalem Endothelium freigesetzt wird, ist eine Reaktion auf eine Scherbelastungsverletzung, die HGF (Hepatozytenwachstumsfaktor) stimuliert, um auf c-met-Rezeptoren zu wirken und die Hepatozytenproliferation einzuleiten. (Paranjpe S et al. 2007, Borowiak M et al. 2004) Portale Hypertonie in Verbindung mit Zirrhose führt nicht zu einer durch Scherbelastung verursachten Verletzung aufgrund von Kapillarisierung von sinusoidalen Endothelzellen (SECs) und Verlust von Siebplatten. (Sato et al. 1997 & Vollmer et al. 1998).

Suenaga M (1983) untersuchte die Rolle von Pfortaderblut bei der Leberregeneration nach partieller Hepatektomie bei Hunden und stellte fest, dass eine ausreichende Menge an Pfortaderblut für die Leberregeneration notwendig ist und eine hohe Konzentration von Aminosäuren im Pfortaderblut einen positiven Einfluss auf den Regenerationsprozess hat. In einer anderen Studie stellten Skov OP et al. (1988) fest, dass Pfortaderblut eine große Menge an EGF (epidermaler Wachstumsfaktor), Pankreashormonen (Insulin, Glukagon) und anderen Wachstumsfaktoren enthält, die aktiv an der Leberregeneration teilnehmen. Bucher NL (1976 und 1977) beobachtete, dass Insulin und Glukagon beide die Leberregeneration und die DNA-Synthese nach Hepatektomie erleichtern, aber dafür ein nicht-portaler Faktor erforderlich ist, da beide keine Hepatozytenproliferation in einer intakten Leber induzieren können, aber sie können Hepatozytenproliferation induzieren bei hepatektomierten und eviszerierten Ratten. Neben diesen beiden (Insulin und Glukagon) sind auch andere Hormone wie Wachstumshormon, Adrenalin, Serotonin usw. an diesem Prozess beteiligt. (Amal ZS et al, 2011; Shi Min Luo, 2004) IL-6 und TNF-α sind zwei Faktoren, die für die Initiierung von PHLR von entscheidender Bedeutung sind. Pfortaderblut enthält aus dem Darm stammende Faktoren wie Lipopolysaccharide, Komplementfaktoren und interzelluläre Adhäsionsmoleküle, die Kupffer-Zellen aktivieren, um IL-6 und TNF-α freizusetzen, die auf parakrine Weise wirken, um die Regeneration einzuleiten (Fausto N 2006, Michelopoulos 2007, Cressman DE et al. 1996, Feingold KR et al. 1988, Sudo K et al. 2008, Yamada Y et al. 1997, Cornell RP et al. 1985). Il-6, TNF-α, VEGF, NO initiieren die Regeneration durch Aktivierung von HGF (Hepatozyten-Wachstumsfaktor), der ein potentes Hepatozyten-Mitogen ist. (Diaz JJ et al. 2011, Cantre D et al. 2008, Rai RM et al. 2005). HGF steuert zusammen mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), dem transformierenden Wachstumsfaktor (TGF), hepatotropen Hormonen und mehreren anderen bekannten und unbekannten Faktoren die Hepatozytenproliferation und -vermehrung. (Fausto N. 1993, Fausto N. und Mead JE. 1989). HGF bindet den Met-Rezeptor auf Hepatozyten und aktiviert deren Wachstum und Proliferation. (Borowick et al 2004) HGF, EGF und TGF alfa sind potente In-vitro-Mitogene, da sie die Hepatozytenproliferation in einer normalen Leber sogar in Abwesenheit anderer Faktoren induzieren können und in Gegenwart von Faktoren wie Zytokinen die Proliferation eines signifikanten Anteils von Hepatozyten stimulieren können. (Block GD et al. 1996, Webber EM et al. 1998) TGF-α kann DNA-Synthese und c-myc-Expression induzieren, wenn es zu Rattenhepatozytenkultur gegeben wird. (Skouteris GG und Menamin MM 1992) Entzündungsmediatoren wie Prostaglandin (PGE-2) spielen auch eine gewisse Rolle bei der Leberregeneration, da sein Spiegel nach Hepatektomie bei Ratten ansteigt, und dieser Prozess ist abhängig von c-AMP; Es wurde festgestellt, dass die Zugabe von Prostaglandinen zur Hepatozytenkultur die DNA-Synthese erhöht. (Tsujii H. et al., 1993) EGF kann neugeborene Rattenhepatozyten in Primärkultur zum Eintritt in die S- und M-Phase stimulieren, die bereits nach 4 Stunden nachgewiesen werden können und zwischen 12 und 16 Stunden ihren Höhepunkt erreichen, danach nimmt sie ab und dieser Effekt kann moduliert werden durch Serumfaktoren und die Gabe von Glucagon und Insulin verstärkt das Wachstum weiter. (Draghi E. et al., 1980) HGF spielt eine beträchtliche Rolle bei PHLR, nachdem es an den Met-Rezeptor gebunden hat, aktiviert es STAT-3 (Signaltransducer und Aktivator der Transkription 3), das die Induktion von frühen Antwortgenen vermittelt, und Met-Mutantenmäuse haben eine beeinträchtigte Leberregeneration gezeigt .( Borowiak M et al. 2004) Huh CG et al. zeigten 2004 in ihrer Studie an Met-Mutantenmäusen, dass der HGF/C-Met-Signalweg eine zentrale Rolle bei der Entwicklung, Leberregeneration und Tumorentstehung spielt. Der HGF/Met-Weg reguliert die Expression vieler Gene, die mit dem Zellzyklus und der Apoptose zusammenhängen, einschließlich p53, Cyclin E und Cyclin B, um den Zellzyklus zu fördern und die Apoptose in den 24 Stunden nach einer partiellen Hepatektomie zu hemmen. (Paranjpe S et al 2007) STAT-3 (Signal Transducer and Activator-3) ist ein Transkriptionsfaktor, der verschiedene primäre Wachstumsreaktionsgene nach Hepatektomie reguliert und durch verschiedene Wachstumsfaktoren und Zytokine aktiviert werden kann. (Li W et al. 2002) Die STAT-3-DNA-Bindungsaktivität steigt in der Restleber innerhalb von 30 Minuten nach PH (partielle Hepatektomie) und erreicht innerhalb von 3 Stunden einen Höhepunkt auf das 30-fache, und dieser Anstieg tritt nach einer Scheinoperation nicht auf. (Cressman DE et al., 1995) Mehrere Proto-Onkogene sind ebenfalls an der Initiierung und Vollendung der Leberregeneration beteiligt, von diesen sind c-fos, c-jun und c-myc wichtige Gene. Die C-fos- und c-jun-Transkriptspiegel steigen in der Leber fast unmittelbar nach der Hepatektomie an und kehren nach 2 Stunden auf den Normalwert zurück. Darauf folgt eine Erhöhung der c-myc m-RNA, die nach 2 Stunden den Höhepunkt erreicht und nach 4 Stunden auf das Grundniveau abfällt. (Fausto N. et al. 1989; Morello D., 1989) In einer weiteren Studie stellten Morello D. et al. (1990) fest, dass der Anstieg der c-myc-RNA nach einer Hepatektomie um ein Vielfaches höher ist als nach einer Scheinoperation.

Zusätzlich zu den oben erwähnten Faktoren sind auch mehrere Zellen wie Ovalzellen, Makrophagen, Blutplättchen und Stammzellen (CD133+) direkt oder indirekt an PHLR beteiligt (Evarts RP et al. 1987, Nakamura T. et al. 1986, Fausto N. 2004, Xiang S. et al. 2012) In einer Studie von amEsch JS (2012) verbesserte die Infusion von CD 133+-Stammzellen die Leberreserve und das Gesamtergebnis nach ausgedehnter Hepatektomie. T-Zellen können auch die Leberregeneration beeinflussen, und Mäuse mit einem Mangel an T-Zellen und Lymphotoxin haben eine verringerte Fähigkeit zur Leberregeneration. (Anders SA et al. 2005, Tumanov AV et al. 2009) Ovalzellen reagieren weniger empfindlich auf die Hemmung durch TGF-beta, das die Proliferation reifer Hepatozyten signifikant hemmen kann, sodass diese Zellen (Ovalzellen) einen alternativen Weg für die Leberregeneration bieten. (Lenanh NN et al. 2007) TGF-beta ist ein Inhibitor der unkontrollierten Heaptozyten-Proliferation und die TGF-beta-m-RNA-Expression erreicht ihren Höhepunkt gegen die Vollendung der Zellteilung und Mitose, es hat auch eine hemmende Wirkung auf die EGF-Aktivität. (Nquyen LN et al. 2007, Braun L et al., 1988, Fausto N. et al. 1990). In einer Studie von Romero GJ et (2005) zeigten heptektomierte TGF-beta-Rezeptor-Knockout-Mäuse eine erhöhte Hepatozytenproliferation und ein erhöhtes Verhältnis von Lebermasse zu Körper.

Scotte M et al. (1997) untersuchten die Zytokinexpression in der Leber nach kleineren und größeren Hepatektomie bei Ratten und fanden heraus, dass TNF und IL-1 nach kleiner und großer Hepatektomie ansteigen, während die IL-6-Hochregulierung nach großer (80 %) Hepatektomie stärker ausgeprägt ist. Li J et al. (2009) verglichen das Regenerationsprofil nach großer (2/3) und kleiner (1/3) Hepatektomie bei Ratten, Genexpressionsprofile 4, 12 und 30 Stunden nach Hepatektomie, obwohl einige Gene eine ähnliche Hoch- und Runterregulation zeigten zeigten eine bevorzugte Expression nach einer großen Hepatektomie. Masson S. et al. (1999) untersuchten auch den Einfluss des Ausmaßes der Resektion auf die Leberregeneration bei Ratten und kamen zu dem Schluss, dass die regenerative Reaktion unabhängig vom Ausmaß der Hepatektomie auftritt, der Verlauf der Regeneration und die Expression von Wachstumsfaktoren jedoch je nach Volumen der resezierten Leber unterschiedlich sind. M Nagino et al. (2011) beobachteten, dass sich die Leber in den ersten zwei Wochen nach einer großen Hepatektomie schnell regeneriert und danach langsam fortschreitet und aufhört, wenn sie 3/4 des ursprünglichen Lebervolumens erreicht, was normalerweise 6 Monate bis 1 Jahr nach der Hepatektomie auftritt. Sie stellten auch fest, dass Faktoren wie Ausmaß der Resektion, Körperoberfläche, Pfortaderresektion, Emobilisierung der Pfortader und ICG-Clearance mit der Regeneration des Lebervolumens nach der Hepatektomie zusammenhängen.