Estudio de Mediadores de la Regeneración Hepática Post Hepatectomía

Ensayo prospectivo no aleatorizado para estudiar la expresión de mediadores de la regeneración hepática posterior a la hepatectomía (PHLR) y comparar con un grupo sin hepatectomía: un estudio piloto

Antecedentes: se han utilizado estudios experimentales que utilizan modelos animales post hepatectomía para estudiar el mecanismo de regeneración del hígado. La hepatectomía para diversas enfermedades y el trasplante de hígado de donante vivo proporcionan un buen modelo humano para estudiar el mecanismo in vivo de la regeneración del hígado. Estos estudios son necesarios para la aplicación clínica del conocimiento obtenido mediante experimentos con animales y guiarán futuras investigaciones para desarrollar nuevas modalidades para el tratamiento de la insuficiencia hepática, la cirrosis y el cáncer.

Introducción :

El hígado es un órgano vital que cumple varias funciones metabólicas y protectoras necesarias para el mantenimiento de la vida y tiene un potencial inherente para regenerarse y restaurar el volumen después de su resección parcial. La regeneración del hígado después de la hepatectomía ocurre principalmente por proliferación de hepatocitos maduros (Fausto N 2003 & 2004); los cambios en la hemodinámica portal y las citocinas (IL-6, TNF-α) se consideran los factores desencadenantes más importantes de este proceso. (Abhshagen K et al 2012, Scotte M et al 1997) Se propone que una mayor entrega de sangre portal al hígado remanente produce una lesión por esfuerzo cortante que conduce a la liberación de factores como NO y VEGF que activan la cascada de regeneración (Marabushi et al 2004). Las citoquinas (IL-6 y TNF-α), NO y VEGF actúan sobre pro HGF (factor de crecimiento de hepatocitos inactivo) para convertirlo en HGF activo que actúa a través de los receptores Met para activar aún más STAT-3, que es un mediador clave de la fase temprana de PHLR. (Abhshgen K et al 2008, Cresman DE et al 1996, Cressman DE1997, Sudo K et al 2008, Borowicak M et al 2004, Paranjpe S et al 2007) El aumento del suministro de sangre portal al hígado remanente también aumenta la disponibilidad por unidad de aminoácidos , hormonas pancreáticas, endotoxinas derivadas del intestino y otros factores hepatotróficos, todos estos pueden actuar directamente para activar la replicación del ADN. (Bucher NL et al 1977, Riehle KJ et al 2011) La administración de una mezcla de aminoácidos a ratas intactas induce una ola de replicación de hepatocitos y su privación bloquea la PHLR. (Mead JE et al 1990) La insulina, el glucagón y la hormona del crecimiento también tienen un impacto significativo en la regeneración del hígado. (Bucher NLR 1976, Shi min luo et al 2004, Amal ZS et al 2011) La capacidad del hígado para regenerarse después de su resección parcial nos permite realizar hepatectomía para trasplante de hígado de donante vivo, neoplasias hepáticas y cánceres biliares. La hepatectomía para estas condiciones también nos proporciona un buen modelo para estudiar el mecanismo in vivo de regeneración del hígado en seres humanos. Estos estudios son importantes para la aplicación clínica del conocimiento obtenido mediante estudios experimentales en animales post hepatectomía. Estos estudios nos ayudarán a conocer los mediadores de varias fases de la regeneración hepática post hepatectomía (PHLR) y guiarán futuras investigaciones para desarrollar nuevos enfoques para la prevención y el manejo de complicaciones post hepatectomía que ponen en peligro la vida como el "síndrome de tamaño pequeño para el tamaño", insuficiencia hepática . Estos senderos ayudarán a comprender el control in vivo de la proliferación celular y pueden resultar vitales para desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para tratar la cirrosis y el cáncer.

Hipótesis nula: La expresión de mediadores de la regeneración hepática post hepatectomía (PHLR) no es diferente entre el grupo de hepatectomía (grupo de estudio) y el grupo sin hepatectomía (grupo de control).

Objetivo: Estudiar el mecanismo de regeneración hepática post hepatectomía (PHLR) y comparar la expresión de mediadores de PHLR entre hepatectomía (grupo de estudio) y un grupo sin hepatectomía (grupo control).

Objetivos :

1. Estudiar los mediadores de PHLR en modelo humano.
2. Comparar la expresión de mediadores PHLR entre hepatectomía (grupo de estudio) y no hepatectomía (grupo control).
3. Para estudiar los cambios iniciales de PHLR en el tejido hepático. Paciente y método: este ensayo prospectivo no aleatorizado se llevará a cabo en dos grupos de pacientes: el grupo de hepatectomía (estudio) y el grupo sin hepatectomía (control) y se reclutarán un mínimo de 10 pacientes adultos consecutivos (18 años o más) en cada grupo. de acuerdo con los criterios de inclusión y exclusión que se detallan a continuación. Se obtendrá el consentimiento informado de los pacientes de ambos grupos. Se recolectará sangre venosa periférica (de una vena del antebrazo) (6 ml) un día antes de la cirugía y después de la cirugía en los días postoperatorios 1, 3, 7, 14 (2 semanas), 42 (6 semanas) y 180 (6 semanas). meses). Se canulará una pequeña rama de la vena porta con un catéter intravenoso de calibre 20 para medir la presión portal y recolectar sangre venosa portal (6 ml) al comienzo de la cirugía pero después de la entrada dentro del abdomen y al final de la cirugía pero antes cierre del abdomen. La recolección de la muestra de sangre de una vena periférica (vena del antebrazo), la medición de la presión portal y la recolección de sangre portal se realizarán en ambos grupos de estudio, pero los pacientes en el grupo de hepatectomía (estudio) se someterán a un procedimiento adicional, es decir, trucut (aguja) biopsia del hígado remanente.

La muestra de biopsia hepática se conservará en solución de formalina y se transferirá al laboratorio de patología para detectar cambios iniciales durante la PHLR y sus posibles mediadores. El tejido hepático normal presente en la muestra resecada servirá como autocontrol. La sangre de la vena periférica y pequeñas ramas de la vena porta se recolectará en un vial estándar utilizado para este propósito y se transferirá al laboratorio para el análisis para detectar mediadores de la regeneración hepática. El análisis de la muestra de sangre se realizará utilizando el método ELISHA. La medición de la presión portal se realizará mediante la canulación de una rama pequeña de la vena porta (p. Vena gastroepiploica) después de la entrada dentro de la vena, este catéter intravenoso se conectará a un registrador de presión digital a través de un tubo de conexión lleno de solución salina normal. Este registrador de presión digital está disponible en cada una de las estaciones de trabajo de anestesia (Marca: Drager) y generalmente da la medida en mm Hg, el registro de presión se realizará antes y después de la cirugía para observar el efecto de la cirugía en la presión portal.

Criterios de inclusión: Pacientes adultos (18 años o más) con neoplasias malignas del tracto gastrointestinal que requieran resección parcial del hígado (grupo de estudio) o resección de otras partes del tracto gastrointestinal (grupo de control) y que estén dispuestos a participar en el estudio.

Criterios de exclusión- Pacientes que no deseen participar en el estudio. Pacientes con condiciones que pueden afectar la expresión del mediador de PHLR (p. inmunosupresión, hepatitis crónica, cirrosis, hipertensión portal, embarazo, uso de anticonceptivos), los pacientes en los que se encuentre una enfermedad avanzada o inoperable durante la cirugía serán excluidos del estudio y los datos recopilados de ellos no se incluirán en el análisis.

Tamaño de la muestra: Mínimo 10 pacientes en cada grupo Diseño: ensayo prospectivo no aleatorizado Lugar del estudio: Departamento de Cirugía Gastrointestinal, GBPH y MAMC, Nueva Delhi Duración: 2 años. Seguimiento: 6 meses Financiamiento: Los investigadores solicitarán financiamiento de las agencias gubernamentales. Mediador de PHLR para ser analizado en sangre periférica por método ELISA - IL-1 IL-6, T N F-α, TNF-β, HGF (factor de crecimiento de hepatocitos), GH (hormona de crecimiento), Insulina y Glucagón.

Examen de muestra de biopsia hepática (Inmunohistoquímica): índice mitótico (Ki 67), EPCAM, STAT-3, receptor para HGF, VEGF, NKAM y CD133.

Métodos estadísticos: Todos los datos se ingresarán en Microsoft Excel y los cálculos estadísticos se realizarán utilizando el software SPSS. Para comparar las medias de la expresión de diversos factores tisulares en el tejido hepático antes y después de la hepatectomía, los investigadores utilizarán la prueba t pareada si la distribución de las variables es normal y la prueba de rango de signos de Wilcox-on para una distribución no normal. Para comparar la expresión de los mediadores de la regeneración hepática en el suero de los pacientes de los grupos de estudio y de control, los investigadores utilizarán la prueba t independiente para una distribución normal y la prueba de Mann Whitney para una distribución no normal. Para estudiar los promedios de los niveles séricos de mediadores de la regeneración hepática en diferentes momentos antes y después de la cirugía, los investigadores utilizarán ANOVA para una distribución normal y la prueba de Friedman para una distribución no normal seguida de una prueba post hoc. Se utilizará un valor de p de 0,5 o inferior para derivar la significación.

Revisión de literatura:

La regeneración del hígado después de la hepatectomía es un proceso muy complejo y ordenado que implica la proliferación de hepatocitos maduros para recuperar el volumen hepático, el mecanismo exacto de la regeneración del hígado no se ha revelado hasta ahora, pero las evidencias basadas en la investigación con animales (ratas, ratones, perros, etc.) indican que el cambio en la hemodinámica portal, las citocinas, el factor de crecimiento (HGF,TGF,EGF), las hormonas (como la GH, la insulina o la adrenalina) participan activamente en este proceso controlado por cientos de genes. (Fausto N 2012 y Michelopoulos 2010) Marabushi et al (2004) propusieron que el aumento agudo en la cantidad de sangre portal entregada al hígado remanente produce una lesión por esfuerzo cortante que conduce a la producción de óxido nítrico (NO), la activación del canal de calcio y la liberación de VEGF; todos ellos juegan un papel clave en la iniciación del proceso de regeneración. Bucher NL (1964) observó que los cambios hemodinámicos en el flujo sanguíneo portal están directamente relacionados con la extensión de la hepatectomía, el aumento de la presión portal después de una hepatectomía del 90% es mucho mayor que después de una hepatectomía del 70%. Sato et al (1997 y 1999) volvieron a confirmar los hallazgos de Bucher NL y también observaron un aumento progresivo de la presión portal a medida que avanza la regeneración del hígado y su declive hacia su finalización. Estudios experimentales realizados por varios investigadores como Wang y Lautt (1998), Cantre D et al (2008), Schoen JM et al (2001) y Mei Y et al (2011) confirmaron aún más el papel del NO en la activación de los factores responsables de la proliferación de hepatocitos. El VEGF liberado del endotelio sinusoidal es una respuesta a la lesión por esfuerzo cortante que estimula el HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) para que actúe sobre los receptores c-met e inicie la proliferación de hepatocitos. (Paranjpe S et al 2007,Borowiak M et al 2004) La hipertensión portal asociada con la cirrosis no conduce a una lesión asociada a la tensión de cizallamiento debido a la capilarización de las células endoteliales sinusoidales (SEC) y la pérdida de placas de tamiz. (Sato et al 1997 y Vollmer et al 1998).

Suenaga M (1983) estudió el papel de la sangre portal en la regeneración hepática después de una hepatectomía parcial en perros y notó que la cantidad adecuada de sangre portal es necesaria para la regeneración hepática y que una alta concentración de aminoácidos en la sangre portal tiene un impacto positivo en el proceso de regeneración. En otro estudio, Skov OP et al (1988) observaron que la sangre portal contiene una gran cantidad de EGF (factor de crecimiento epidérmico), hormonas pancreáticas (insulina, glucagón) y otros factores de crecimiento que participan activamente en la regeneración del hígado. Bucher NL (1976 y 1977) observó que tanto la insulina como el glucagón facilitan la regeneración del hígado y la síntesis de ADN después de la hepatectomía, pero se requiere algún factor no portal para esto, ya que ninguno de ellos logró inducir la proliferación de hepatocitos en un hígado intacto, pero pueden inducir la proliferación de hepatocitos. en ratas hepatectomizadas y evisceradas. Además de estas dos (insulina y glucagón), otras hormonas como la hormona del crecimiento, la adrenalina, la serotonina, etc. también participan en este proceso. (Amal ZS et al, 2011; Shi Min Luo, 2004) IL-6 y TNF-α son dos factores que son vitales para el inicio de PHLR, la sangre portal contiene factores derivados del intestino como lipopolisacáridos, factores del complemento y moléculas de adhesión intercelular que activar las células de Kupffer para que liberen IL-6 y TNF-α que actúan de manera paracrina para iniciar la regeneración. (Fausto N 2006, Michelopoulos 2007, Cressman DE et al 1996, Feingold KR et al 1988, Sudo K et al 2008, Yamada Y et al 1997, Cornell RP et al 1985). Il-6, TNF-α, VEGF, NO inician la regeneración activando el HGF (factor de crecimiento de hepatocitos), que es un potente mitógeno de hepatocitos. (Díaz JJ et al 2011, Cantre D et al 2008, Rai RM et al 2005). El HGF junto con el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento transformante (TGF), las hormonas hepatotróficas y varios otros factores conocidos y desconocidos controlan la proliferación y propagación de los hepatocitos. (Fausto N 1993, Fausto N y Mead JE 1989). El HGF se une al receptor Met en los hepatocitos y activa su crecimiento y proliferación. (Borowick et al 2004) HGF, EGF y TGF alfa son potentes mitógenos in vitro ya que pueden inducir la proliferación de hepatocitos en un hígado normal incluso en ausencia de otros factores y en presencia de factores como las citoquinas pueden estimular la proliferación de una proporción significativa de hepatocitos. (Block GD et al 1996, Webber EM et al 1998) El TGF-α puede inducir la síntesis de ADN y la expresión de c-myc cuando se añade al cultivo de hepatocitos de rata. (Skouteris GG y Menamin MM 1992) Los mediadores inflamatorios como la prostaglandina (PGE-2) también juegan algún papel en la regeneración del hígado ya que su nivel aumenta después de la hepatectomía en ratas, y este proceso depende de c-AMP; Se ha descubierto que la adición de prostaglandinas al cultivo de hepatocitos aumenta la síntesis de ADN. (Tsujii H et al, 1993) EGF puede estimular el hepatocito de rata neonatal en cultivo primario para entrar en las fases S y M, que pueden detectarse a las 4 horas y alcanzar su punto máximo entre 12 y 16 horas después, disminuye y este efecto puede modularse por factores séricos y la administración de glucagón e insulina amplifica aún más el crecimiento. (Draghi E et al, 1980) HGF tiene un papel considerable en PHLR, después de unirse al receptor met activa STAT-3 (transductor de señal y activador de la transcripción 3) que median la inducción de genes de respuesta temprana y los ratones mutantes Met han mostrado una regeneración hepática alterada .( Borowiak M et al 2004) Huh CG et al en 2004 mediante su estudio en ratones mutantes Met mostraron que la vía de señalización HGF/C-Met juega un papel central en el desarrollo, la regeneración del hígado y la tumorigénesis. La ruta HGF/Met regula la expresión de muchos genes relacionados con el ciclo celular y la apoptosis, incluidos p53, ciclina E y ciclina B, para promover el ciclo celular e inhibir la apoptosis en las 24 horas posteriores a la hepatectomía parcial. (Paranjpe S et al 2007) STAT-3 (transductor de señal y activador-3) es un factor de transcripción que regula varios genes de respuesta de crecimiento primario después de la hepatectomía y puede ser activado por varios factores de crecimiento y citoquinas. (Li W et al 2002) La actividad de unión al ADN de STAT-3 aumenta en el hígado remanente dentro de los 30 minutos posteriores a la PH (hepatectomía parcial) y alcanza un máximo de 30 veces dentro de las 3 horas y este aumento no ocurre después de la cirugía simulada. (Cressman DE et al, 1995) Varios protooncogenes también están implicados en el inicio y finalización de la regeneración del hígado, de estos c-fos, c-jun y c-myc son genes importantes. Los niveles de transcripción de C-fos y c-jun aumentan en el hígado casi inmediatamente después de la hepatectomía y vuelven a la normalidad a las 2 horas. A esto le sigue la elevación del ARN de c-myc m que alcanza su punto máximo a las 2 horas y desciende hasta el nivel basal a las 4 horas. (Fausto N et al 1989; Morello D, 1989) En un estudio adicional, Morello D et al (1990) encontró que el aumento en el ARN de c-myc después de la hepatectomía es mucho mayor que después de la cirugía simulada.

Además de los factores mencionados anteriormente, varias células como las células ovales, los macrófagos, las plaquetas y las células madre (CD133+) también participan en PHLR directa o indirectamente. (Evarts RP et al 1987, Nakamura T et al 1986, Fausto N 2004, Xiang S et al 2012) En un estudio realizado por amEsch JS (2012), la infusión de células madre CD 133+ mejoró la reserva hepática y el resultado general después de una hepatectomía extendida. Las células T también pueden afectar la regeneración del hígado y los ratones deficientes en células T y linfotoxina tienen una menor capacidad de regeneración del hígado. (Anders SA et al 2005, Tumanov AV et al 2009) Las células ovales son menos sensibles a la inhibición de TGF-beta, que puede inhibir significativamente la proliferación de hepatocitos maduros, por lo que estas células (células ovales) proporcionan una ruta alternativa para la regeneración del hígado. (Lenanh NN et al 2007) TGF beta es un inhibidor de la proliferación descontrolada de hepatocitos y la expresión de ARNm de TGF beta alcanza su punto máximo hacia la finalización de la división celular y la mitosis, también tiene un efecto inhibidor sobre la actividad de EGF. (Nquyen LN et al 2007, Braun L et al, 1988, Fausto N et al 1990). En un estudio realizado por Romero GJ et (2005), los ratones heptectomizados con eliminación del receptor de TGF beta mostraron una mayor proliferación de hepatocitos y una mayor relación masa hepática/cuerpo.

Scotte M et al (1997) estudiaron la expresión de citoquinas en el hígado después de una hepatectomía menor y mayor en ratas y encontraron que el TNF y la IL-1 aumentan después de la hepatectomía menor y mayor, mientras que la regulación positiva de IL-6 es más prominente después de la hepatectomía mayor (80 %). Li J et al (2009) compararon el perfil de regeneración después de una hepatectomía mayor (2/3) y menor (1/3) en ratas, los perfiles de expresión génica a las 4, 12 y 30 horas después de la hepatectomía mostraron una regulación ascendente y descendente similar, aunque algunos genes mostró una expresión preferencial después de una hepatectomía mayor. Masson S et al (1999) también estudiaron el impacto de la extensión de la resección en la regeneración del hígado en ratas y concluyeron que la respuesta regenerativa se produce independientemente de la extensión de la hepatectomía, pero el curso de la regeneración y la expresión de los factores de crecimiento difieren según el volumen de hígado resecado. M Nagino et al (2011) observaron que el hígado se regenera rápidamente en las primeras dos semanas después de una hepatectomía mayor y luego progresa lentamente y se detiene cuando alcanza 3/4 del volumen hepático original, lo que generalmente ocurre entre 6 meses y 1 año después de la hepatectomía. También notaron que factores como la extensión de la resección, el área de superficie corporal, la resección de la vena porta, la emovilización de la vena porta y la eliminación de ICG están asociados con la regeneración del volumen hepático después de la hepatectomía.