Изучение медиаторов постгепатэктомической регенерации печени

Проспективное нерандомизированное исследование по изучению экспрессии медиаторов регенерации печени после гепатэктомии (PHLR) и сравнение с группой без гепатэктомии: пилотное исследование

Предыстория: экспериментальные исследования с использованием животных моделей после гепатэктомии использовались для изучения механизма регенерации печени. Гепатэктомия при различных заболеваниях и трансплантация печени от живого донора представляют собой хорошую человеческую модель для изучения механизма регенерации печени in vivo. Эти исследования необходимы для клинического применения знаний, полученных в ходе экспериментов на животных, и будут служить ориентиром для дальнейших исследований по разработке новых методов лечения печеночной недостаточности, цирроза и рака.

Введение :

Печень является жизненно важным органом, выполняющим различные метаболические и защитные функции, необходимые для поддержания жизни, и обладает врожденным потенциалом к ​​регенерации и восстановлению объема после ее частичной резекции. Регенерация печени после гепатэктомии происходит в основном за счет пролиферации зрелых гепатоцитов (Fausto N 2003 & 2004); изменения портальной гемодинамики и цитокинов (ИЛ-6, ФНО-α) считаются наиболее важными триггерными факторами этого процесса. (Abhshagen K et al 2012, Scotte M et al 1997) Предполагается, что повышенная доставка портальной крови к остатку печени вызывает травму напряжения сдвига, приводящую к высвобождению таких факторов, как NO и VEGF, которые активируют каскад регенерации (Marabushi et al 2004). Цитокины (IL-6 и TNF-α), NO и VEGF действуют на pro HGF (неактивный фактор роста гепатоцитов), превращая его в активный HGF, который действует через рецепторы Met для дальнейшей активации STAT-3, который является ключевым медиатором ранней фазы гепатоцитов. ФЛР. (Abhshgen K et al 2008, Cresman DE et al 1996, Cressman DE 1997, Sudo K et al 2008, Borowicak M et al 2004, Paranjpe S et al 2007) Увеличение поступления портальной крови в оставшуюся печень также увеличивает доступность аминокислот на единицу , гормоны поджелудочной железы, кишечные эндотоксины и другие гепатотропные факторы, все они могут действовать непосредственно, чтобы активировать репликацию ДНК. (Bucher NL et al 1977, Riehle KJ et al 2011) Введение смеси аминокислот интактным крысам индуцирует волну репликации гепатоцитов, а ее лишение блокирует PHLR. (Mead JE et al 1990) Инсулин, глюкагон и гормон роста также оказывают значительное влияние на регенерацию печени. (Bucher NLR 1976, Shi min luo et al 2004, Amal ZS et al 2011) Способность печени к регенерации после ее частичной резекции позволяет нам выполнять гепатэктомию при трансплантации печени живого донора, новообразованиях печени и раке желчных путей. Гепатэктомия при этих состояниях также дает нам хорошую модель для изучения механизма регенерации печени in vivo у людей. Эти исследования важны для клинического применения знаний, полученных в ходе экспериментальных исследований на животных после гепатэктомии. Эти исследования помогут нам узнать медиаторы различных фаз регенерации печени после гепатэктомии (PHLR) и послужат ориентиром для будущих исследований по разработке новых подходов к профилактике и лечению угрожающих жизни осложнений после гепатэктомии, таких как «синдром малого размера», печеночная недостаточность. . Эти следы помогут понять контроль клеточной пролиферации in vivo и могут оказаться жизненно важными для разработки новых терапевтических подходов к лечению цирроза и рака.

Нулевая гипотеза: экспрессия медиаторов регенерации печени после гепатэктомии (PHLR) не различается между гепатэктомией (исследуемая группа) и группой без гепатэктомии (контрольная группа).

Цель: изучить механизм регенерации печени после гепатэктомии (PHLR) и сравнить экспрессию медиаторов PHLR между гепатэктомией (исследуемая группа) и группой без гепатэктомии (контрольная группа).

Цели:

1. Изучить медиаторы PHLR на модели человека.
2. Сравнить экспрессию медиаторов PHLR при гепатэктомии (исследуемая группа) и без гепатэктомии (контрольная группа).
3. Изучить начальные изменения PHLR в ткани печени. Пациент и метод. Это проспективное нерандомизированное исследование будет проведено на двух группах пациентов — группе пациентов с гепатэктомией (исследование) и группе без гепатэктомии (контрольной группе), и в каждой группе будет набрано не менее 10 последовательных взрослых пациентов (18 лет и старше). в соответствии с критериями включения и исключения, приведенными ниже. Информированное согласие будет получено от пациентов в обеих группах. Периферическую (из вены предплечья) венозную кровь (6 мл) собирают за сутки до операции и после операции в послеоперационные 1, 3, 7, 14 сутки (2 нед), 42 (6 нед) и 180 (6 нед). месяцы). Небольшая ветвь воротной вены будет канюлирована внутривенным катетером 20G для измерения портального давления и забора портальной венозной крови (6 мл) в начале операции, но после входа в брюшную полость и в конце операции, но перед закрытие живота. Сбор образца крови из периферической вены (вены предплечья), измерение портального давления и сбор портальной крови будут проводиться в обеих исследуемых группах, но пациенты в группе гепатэктомии (исследуемой) будут подвергаться дополнительной процедуре, т. е. trucut (игле). биопсия остатка печени.

Образец биопсии печени будет сохранен в растворе формалина и передан в лабораторию патологии для выявления начальных изменений во время PHLR и их возможных медиаторов, нормальная ткань печени, присутствующая в резецированном образце, будет служить самоконтролем. Кровь из периферической вены и мелких ветвей воротной вены собирают в стандартный флакон, используемый для этой цели, и передают в лабораторию для анализа на выявление медиаторов регенерации печени. Анализ образца крови будет сделан с использованием метода ELISHA. Измерение портального давления будет проводиться путем катетеризации небольшой ветви воротной вены (например, желудочно-сальниковая вена) после входа в вену этот внутривенный катетер будет подключен к цифровому регистратору давления через соединительную трубку, заполненную физиологическим раствором. Этот цифровой регистратор давления доступен на каждой анестезиологической рабочей станции (производитель: Drager) и обычно измеряет давление в мм рт.ст., запись давления будет производиться до и после операции, чтобы наблюдать влияние операции на портальное давление.

Критерии включения: взрослые пациенты (18 лет и старше) со злокачественными новообразованиями желудочно-кишечного тракта, требующие частичной резекции печени (основная группа) или резекции других отделов желудочно-кишечного тракта (контрольная группа) и желающие участвовать в исследовании.

Критерии исключения: пациенты, не желающие участвовать в исследовании. Пациенты с состояниями, которые могут повлиять на экспрессию медиатора PHLR (например, иммуносупрессия, хронический гепатит, цирроз печени, портальная гипертензия, беременность, использование противозачаточных средств), пациенты, у которых во время операции будет обнаружено прогрессирующее или неоперабельное заболевание, будут исключены из исследования, а данные, полученные от них, не будут включены в анализ.

Размер выборки: не менее 10 пациентов в каждой группе. Дизайн: проспективное нерандомизированное исследование. Место проведения: отделение желудочно-кишечной хирургии, GBPH и MAMC, Нью-Дели. Продолжительность: 2 года. Последующие действия: 6 месяцев. Финансирование: Следователи будут обращаться за финансированием к государственным учреждениям. Медиатор PHLR, подлежащий анализу в периферической крови методом ИФА - IL-1, IL-6, TN F-α, TNF-β, HGF (фактор роста гепатоцитов), GH (гормон роста), инсулин и глюкагон.

Исследование биоптата печени (Иммуногистохимия): митотический индекс (Ki 67), EPCAM, STAT-3, рецепторы HGF, VEGF, NKAM и CD133.

Статистические методы: все данные будут введены в Microsoft Excel, а статистические расчеты будут выполнены с использованием программного обеспечения SPSS. Чтобы сравнить средства экспрессии различных тканевых факторов в ткани печени до и после гепатэктомии, исследователи должны использовать парный критерий Стьюдента, если распределение переменных является нормальным, и ранговый критерий знака Уилкокса для ненормального распределения. Для сравнения экспрессии медиаторов регенерации печени в сыворотке крови больных основной и контрольной групп используют независимый t-критерий для нормального распределения и критерий Манна-Уитни для ненормального распределения. Для изучения средних уровней медиаторов регенерации печени в сыворотке крови в разные моменты времени до и после операции исследователи должны использовать ANOVA для нормального распределения и критерий Фридмана для ненормального распределения с последующим апостериорным тестом. Значение P, равное 0,5 или ниже, будет использоваться для получения значимости.

Литературный обзор:

Регенерация печени после гепатэктомии представляет собой очень сложный и упорядоченный процесс, который включает пролиферацию зрелых гепатоцитов для восстановления объема печени, точный механизм регенерации печени до сих пор не раскрыт, но данные, основанные на исследованиях на животных (крысы, мыши, собаки и т. д.), указывают на то, что острый изменение портальной гемодинамики, цитокины, фактор роста (HGF, TGF, EGF), гормоны (такие как GH, инсулин или адреналин) активно участвуют в этом процессе, который контролируется сотнями генов. (Fausto N 2012 и Michelopoulos 2010) Marabushi et al (2004) предположили, что острое увеличение количества портальной крови, доставляемой в оставшуюся часть печени, вызывает травму напряжения сдвига, которая приводит к выработке оксида азота (NO), активации кальциевых каналов и высвобождению VEGF; все они играют ключевую роль в инициировании процесса регенерации. Bucher NL (1964) заметил, что гемодинамические изменения портального кровотока прямо связаны с объемом гепатэктомии, повышение портального давления после 90% гепатэктомии значительно выше, чем после 70% гепатэктомии. Sato et al (1997&1999) подтвердили результаты Bucher NL, а также наблюдали прогрессивное повышение портального давления по мере прогрессирования регенерации печени и его снижение к ее завершению. Экспериментальные исследования, проведенные различными исследователями, такими как Wang and Lautt (1998), Cantre D et al (2008), Schoen JM et al (2001) и Mei Y et al (2011), дополнительно подтвердили роль NO в активации факторов, ответственных за пролиферацию гепатоцитов. VEGF, высвобождаемый из синусоидального эндотелия, является реакцией на травму при сдвиговом напряжении, стимулирует HGF (фактор роста гепатоцитов), чтобы воздействовать на c-met рецепторы и инициировать пролиферацию гепатоцитов. (Paranjpe S et al 2007, Borowiak M et al 2004) Портальная гипертензия, связанная с циррозом печени, не приводит к повреждению, связанному с напряжением сдвига, из-за капилляризации синусоидальных эндотелиальных клеток (SEC) и потери ситовидных пластинок. (Сато и др., 1997 г. и Фоллмер и др., 1998 г.).

Suenaga M (1983) изучал роль портальной крови в регенерации печени после резекции печени у собак и заметил, что для регенерации печени необходимо достаточное количество портальной крови, а высокая концентрация аминокислот в портальной крови положительно влияет на процесс регенерации. В другом исследовании Skov OP et al (1988) отметили, что портальная кровь содержит большое количество EGF (эпидермальный фактор роста), гормонов поджелудочной железы (инсулин, глюкагон) и других факторов роста, которые активно участвуют в регенерации печени. Bucher NL (1976 и 1977) заметил, что инсулин и глюкагон способствуют регенерации печени и синтезу ДНК после гепатэктомии, но для этого требуется некоторый непортальный фактор, поскольку оба они не индуцируют пролиферацию гепатоцитов в интактной печени, но они могут индуцировать пролиферацию гепатоцитов. у гепатэктомированных и эвисцерированных крыс. В дополнение к этим двум (инсулину и глюкагону) в этом процессе также участвуют другие гормоны, такие как гормон роста, нор-адреналин, серотонин и т. д. (Amal ZS et al,2011; Shi Min Luo, 2004) IL-6 и TNF-α являются двумя факторами, жизненно важными для инициации PHLR, портальная кровь содержит факторы кишечного происхождения, такие как липополисахариды, факторы комплемента и молекулы межклеточной адгезии, которые активировать клетки Купфера для высвобождения IL-6 и TNF-α, которые действуют паракринным образом, чтобы инициировать регенерацию (Фаусто N 2006, Michelopoulos 2007, Cressman DE et al 1996, Feingold KR et al 1988, Sudo K et al 2008, Yamada Y et al 1997, Cornell RP et al 1985). IL-6, TNF-α, VEGF, NO инициируют регенерацию, активируя HGF (фактор роста гепатоцитов), который является мощным митогеном гепатоцитов. (Диас Дж. Дж. и др., 2011 г., Кантре Д. и др., 2008 г., Рай Р. М. и др., 2005 г.). HGF вместе с эпидермальным фактором роста (EGF), фактором роста фибробластов (FGF), трансформирующим фактором роста (TGF), гепатотропными гормонами и несколькими другими известными и неизвестными факторами контролируют пролиферацию и размножение гепатоцитов. (Fausto N 1993, Fausto N и Mead JE 1989). HGF связывает рецептор Met на гепатоцитах и ​​активирует их рост и пролиферацию (Borowick). et al 2004) HGF, EGF и TGF альфа являются мощными митогенами in vitro, поскольку они могут индуцировать пролиферацию гепатоцитов в нормальной печени даже в отсутствие других факторов, а в присутствии таких факторов, как цитокины, они могут стимулировать пролиферацию значительной части гепатоцитов. (Block GD et al 1996, Webber EM et al 1998) TGF-α может индуцировать синтез ДНК и экспрессию c-myc при добавлении в культуру гепатоцитов крысы. (Skouteris GG и Menamin MM 1992) Медиаторы воспаления, такие как простагландин (PGE-2), также играют некоторую роль в регенерации печени, поскольку его уровень увеличивается после гепатэктомии у крыс, и этот процесс зависит от цАМФ; Было обнаружено, что добавление простагландинов к культуре гепатоцитов увеличивает синтез ДНК. (Tsujii H et al, 1993) EGF может стимулировать неонатальные крысиные гепатоциты в первичной культуре для вступления в фазы S и M, которые могут быть обнаружены уже через 4 часа и достигают пика между 12 и 16 часами, после чего он снижается, и этот эффект можно модулировать. сывороточными факторами и введение глюкагона и инсулина еще больше усиливает рост. (Draghi E et al, 1980) HGF играет значительную роль в PHLR, после связывания с мет-рецептором он активирует STAT-3 (преобразователь сигнала и активатор транскрипции 3), который опосредует индукцию генов раннего ответа, и у мышей с мутацией Met наблюдается нарушение регенерации печени. .( Borowiak M et al 2004) Huh CG et al в 2004 году в своем исследовании на мутантных мышах Met показали, что сигнальный путь HGF/C-Met играет центральную роль в развитии, регенерации печени и онкогенезе. Путь HGF/Met регулирует экспрессию многих генов, связанных с клеточным циклом и апоптозом, включая p53, циклин E и циклин B, чтобы стимулировать клеточный цикл и ингибировать апоптоз в течение 24 часов после частичной гепатэктомии. ( Paranjpe S et al 2007) STAT-3 (преобразователь сигнала и активатор-3) представляет собой фактор транскрипции, который регулирует различные гены первичного ответа на рост после гепатэктомии, и его можно активировать различными факторами роста и цитокинами (Li). W et al 2002) ДНК-связывающая активность STAT-3 увеличивается в остаточной печени в течение 30 минут после ПГ (частичной гепатэктомии) и достигает пика в 30 раз в течение 3 часов, и это увеличение не происходит после ложной операции. (Cressman DE et al, 1995) Несколько протоонкогенов также участвуют в инициации и завершении регенерации печени, из них c-fos, c-jun и c-myc являются важными генами. Уровни транскриптов C-fos и c-jun увеличиваются в печени почти сразу после гепатэктомии и возвращаются к норме через 2 часа. За этим следует повышение уровня c-myc m РНК, которое достигает пика через 2 часа и падает до исходного уровня через 4 часа. (Fausto N et al 1989; Morello D, 1989) В дальнейшем исследовании Morello D et al (1990) обнаружили, что увеличение c-myc РНК после гепатэктомии во много раз выше, чем после ложной операции.

В дополнение к факторам, упомянутым выше, некоторые клетки, такие как овальные клетки, макрофаги, тромбоциты и стволовые клетки (CD133+), также прямо или косвенно участвуют в PHLR (Эвартс). RP et al 1987, Nakamura T et al 1986, Fausto N 2004, Xiang S et al 2012) В исследовании amEsch JS (2012) инфузия стволовых клеток CD 133+ улучшила печеночный резерв и общий результат после расширенной гепатэктомии. Т-клетки также могут влиять на регенерацию печени, а у мышей с дефицитом Т-клеток и лимфотоксинов снижается способность к регенерации печени. (Андерс С.А. и др. 2005, Туманов А.В. и др. 2009) Овальные клетки менее чувствительны к ингибированию TGF-бета, что может значительно ингибировать пролиферацию зрелых гепатоцитов, поэтому эти клетки (овальные клетки) обеспечивают альтернативный путь регенерации печени. (Lenanh NN et al 2007) TGF-бета является ингибитором неконтролируемой пролиферации геаптоцитов, а экспрессия м-РНК TGF-бета достигает пика к завершению клеточного деления и митоза, он также оказывает ингибирующее действие на активность EGF. (Нкуен Л.Н. и др., 2007 г., Браун Л. и др., 1988 г., Фаусто Н. и др., 1990 г.). В исследовании Romero GJ et (2005) у мышей, подвергшихся гептэктомии с нокаутом бета-рецептора TGF, наблюдалась повышенная пролиферация гепатоцитов и увеличенное отношение массы печени к телу.

Scotte M. и коллеги (1997) изучали экспрессию цитокинов в печени после малой и большой гепатэктомии у крыс и обнаружили, что TNF и IL-1 увеличиваются после малой и большой гепатэктомии, в то время как повышение уровня IL-6 более заметно после большой (80%) гепатэктомии. Li J et al (2009) сравнили профиль регенерации после большой (2/3) и малой (1/3) гепатэктомии у крыс, профили экспрессии генов через 4, 12 и 30 часов после гепатэктомии показали сходную регуляцию вверх и вниз, хотя некоторые гены показали преимущественное выражение после обширной гепатэктомии. Masson S и коллеги (1999) также изучали влияние степени резекции на регенерацию печени у крыс и пришли к выводу, что регенеративная реакция возникает независимо от степени гепатэктомии, но ход регенерации и экспрессия факторов роста различаются в зависимости от объема резецированной печени. M Nagino et al (2011) заметили, что печень быстро регенерирует в первые две недели после обширной гепатэктомии, а затем прогрессирует медленно и останавливается, когда достигает 3/4 исходного объема печени, что обычно происходит в период от 6 месяцев до 1 года после гепатэктомии. Они также заметили, что такие факторы, как степень резекции, площадь поверхности тела, резекция воротной вены, эммобилизация воротной вены и клиренс ICG, связаны с восстановлением объема печени после гепатэктомии.