Studie mediátorů regenerace jater po hepatektomii

Prospektivní nerandomizovaná studie ke studiu exprese mediátorů regenerace jater po hepatektomii (PHLR) a srovnání se skupinou bez hepatektomie: pilotní studie

Pozadí: Ke studiu mechanismu regenerace jater byly použity experimentální studie na zvířecích modelech po hepatektomii. Hepatektomie pro různá onemocnění a transplantace jater od žijícího dárce poskytují dobrý lidský model pro studium mechanismu regenerace jater in vivo. Tyto studie jsou nezbytné pro klinickou aplikaci poznatků získaných pokusy na zvířatech a budou vodítkem pro další výzkum s cílem vyvinout nové způsoby léčby selhání jater, cirhózy a rakoviny.

Úvod :

Játra jsou životně důležitý orgán, který slouží různým metabolickým a ochranným funkcím nezbytným pro udržení života a po částečné resekci mají vlastní potenciál k regeneraci a obnovení objemu. K regeneraci jater po hepatektomii dochází především proliferací zralých hepatocytů (Fausto N 2003 & 2004); změny portální hemodynamiky a cytokinů (IL-6, TNF-α ), které jsou považovány za nejdůležitější spouštěcí faktory tohoto procesu. (Abhshagen K et al 2012, Scotte M et al 1997) Předpokládá se, že zvýšené dodávání portální krve do zbytkových jater způsobuje poškození smykovým napětím vedoucí k uvolnění faktorů, jako je NO a VEGF, které aktivují regenerační kaskádu (Marabushi et al 2004). Cytokiny (IL-6 a TNF-α), NO a VEGF působí na pro HGF (inaktivní růstový faktor hepatocytů) a přeměňují jej na aktivní HGF, který působí prostřednictvím Met receptorů a dále aktivuje STAT-3, který je klíčovým mediátorem rané fáze PHLR. (Abhshgen K a kol. 2008, Cresman DE a kol. 1996, Cressman DE1997, Sudo K a kol. 2008, Borowicak M a kol. 2004, Paranjpe S a kol. 2007) Zvýšená dodávka portální krve do zbytkových jater také zvyšuje dostupnost aminokyselin na jednotku hormony slinivky břišní, endotoxiny odvozené ze střeva a další hepatotrofní faktory, všechny tyto mohou působit přímo na aktivaci replikace DNA. (Bucher NL et al 1977, Riehle KJ et al 2011) Podání směsi aminokyselin intaktním potkanům indukuje vlnu replikace hepatocytů a její deprivace blokuje PHLR. (Mead JE et al 1990) Inzulín, glukagon a růstový hormon mají také významný vliv na regeneraci jater. (Bucher NLR 1976, Shi min luo et al 2004, Amal ZS et al 2011) Schopnost regenerace jater po jejich částečné resekci nám umožňuje provádět hepatektomii pro transplantaci jater od žijícího dárce, jaterní novotvary a rakovinu žlučových cest. Hepatektomie pro tyto stavy nám také poskytuje dobrý model pro studium in vivo mechanismu regenerace jater u lidí. Tyto studie jsou důležité pro klinickou aplikaci poznatků získaných experimentálními studiemi na zvířatech po hepatektomii. Tyto studie nám pomohou poznat mediátory různých fází regenerace jater po hepatektomii (PHLR) a povedou budoucí výzkum k vývoji nových přístupů k prevenci a zvládání život ohrožujících komplikací po hepatektomii, jako je „Small for size syndrome“, jaterní selhání. . Tyto cesty pomohou porozumět in vivo kontrole buněčné proliferace a mohou se ukázat jako zásadní pro vývoj nových terapeutických přístupů k léčbě cirhózy a rakoviny.

Nulová hypotéza: Exprese mediátorů regenerace jater po hepatektomii (PHLR) se neliší mezi hepatektomií (studovaná skupina) a skupinou bez hepatektomie (kontrolní skupina).

Cíl: Studovat mechanismus regenerace jater po hepatektomii (PHLR) a porovnat expresi mediátorů PHLR mezi hepatektomií (studovaná skupina) a skupinou bez hepatektomie (kontrolní skupina).

Cíle:

1. Studovat mediátory PHLR na lidském modelu.
2. Porovnat expresi mediátorů PHLR mezi hepatektomií (studovaná skupina) a nehepatektomií (kontrolní skupina).
3. Studovat počáteční změny PHLR v jaterní tkáni. Pacient a metoda: Tato prospektivní nerandomizovaná cesta bude provedena na dvou skupinách pacientů – skupině pacientů s hepatektomií (studijní) a skupině bez hepatektomie (kontrolní) a v každé skupině bude vybráno minimálně 10 po sobě jdoucích dospělých pacientů (18 let nebo více). podle kritérií pro zařazení a vyloučení uvedených níže. Informovaný souhlas bude získán od pacientů v obou skupinách. Den před operací a po operaci bude odebrána periferní (z žíly na předloktí) žilní krev (6 ml) den před operací a po operaci v pooperační den 1, 3, 7, 14 (2 týdny), 42 (6 týdnů) a 180 (6 měsíce). Do malé větve portální žíly bude zavedena kanyla 20 gauge intravenózní katétr pro měření portálního tlaku a odběr portální žilní krve (6 ml) na začátku operace, ale po vstupu do břicha a na konci operace, ale před uzavření břicha. Odběr vzorku krve z periferní žíly (vena na předloktí), měření portálního tlaku a odběr portální krve bude proveden v obou sledovaných skupinách, ale pacienti ve skupině s hepatektomií (studijní) podstoupí další proceduru, tj. trucut (jehlu) biopsie ze zbytku jater.

Vzorek jaterní biopsie bude uchován ve formalínovém roztoku a přenesen do patologické laboratoře k detekci počátečních změn během PHLR a jejich možných mediátorů, normální jaterní tkáň přítomná v resekovaném vzorku bude sloužit jako sebekontrola. Krev z periferní žíly a malých větví portální žíly bude odebrána do standardní lahvičky používané k tomuto účelu a přenesena do laboratoře k analýze k detekci mediátorů regenerace jater. Analýza vzorku krve bude provedena metodou ELISHA. Měření portálního tlaku bude provedeno kanulací malé větve portální žíly (např. Gastro epiploická žíla) po vstupu do žíly bude tento intravenózní katétr připojen k digitálnímu záznamníku tlaku přes spojovací trubici naplněnou normálním fyziologickým roztokem. Tento digitální záznamník tlaku je k dispozici na každé anesteziologické pracovně (Výrobce: Drager) a obvykle poskytuje měření v mm Hg, záznam tlaku bude proveden před a po operaci, aby se sledoval vliv operace na portální tlak.

Kritéria zařazení: Dospělí pacienti (18 let a více) s maligními novotvary gastrointestinálního traktu, kteří vyžadují buď částečnou resekci jater (studovaná skupina) nebo resekci jiných částí gastrointestinálního traktu (kontrolní skupina) a jsou ochotni se studie zúčastnit.

Kritéria vyloučení – pacienti, kteří nejsou ochotni se studie zúčastnit. Pacienti se stavy, které mohou ovlivnit expresi mediátoru PHLR (např. imunosuprese, chronická hepatitida, cirhóza, portální hypertenze, těhotenství, užívání antikoncepce), pacienti, u kterých bude během operace zjištěno pokročilé nebo neoperovatelné onemocnění, budou ze studie vyloučeni a data od nich získaná nebudou zahrnuta do analýzy.

Velikost vzorku: Minimálně 10 pacientů v každé skupině Design: prospektivní nerandomizovaná trasa Místo studie: Klinika gastrointestinální chirurgie, GBPH a MAMC, New Delhi Délka: 2 roky. Následná kontrola: 6 měsíců Financování: Vyšetřovatelé požádají o financování vládní agentury. Mediátor PHLR analyzovaný v periferní krvi metodou ELISA - IL-1 IL-6, TNF-α, TNF-β, HGF (hepatocytový růstový faktor), GH (růstový hormon), inzulín a glukagon.

Vyšetření vzorku jaterní biopsie (Imunohistochemie): mitotický index ( Ki 67), EPCAM, STAT-3, receptor pro HGF, VEGF, NKAM a CD133.

Statistické metody: Všechna data budou zadána v Microsoft excelu a statistické výpočty budou provedeny pomocí softwaru SPSS. Aby bylo možné porovnat průměry exprese různých tkáňových faktorů v jaterní tkáni před a po hepatektomii, vyšetřovatelé použijí párový t test, pokud je distribuce proměnných normální, a test Wilcox-onův znak pořadí pro nenormální distribuci. Pro srovnání exprese mediátorů regenerace jater v séru pacientů ve studijní a kontrolní skupině použijí zkoušející nezávislý t test pro normální distribuci a Mann Whitney test pro nenormální distribuci. Aby bylo možné studovat průměry sérových hladin mediátorů regenerace jater v různých časových okamžicích před a po chirurgickém zákroku, vyšetřovatelé použijí ANOVA pro normální rozdělení a Friedmanův test pro nenormální rozdělení následovaný post hoc testem. Pro odvození významnosti bude použita hodnota P 0,5 nebo nižší.

Přehled literatury:

Regenerace jater po hepatektomii je velmi složitý a řádný proces, který zahrnuje proliferaci zralých hepatocytů, aby se znovu získal objem jater, přesný mechanismus regenerace jater nebyl dosud odhalen, ale důkazy založené na výzkumech na zvířatech (potkani, myši, pes atd.) naznačují, že akutní změna portální hemodynamiky, cytokiny, růstový faktor (HGF,TGF,EGF), hormony (jako GH, inzulín, ani adrenalin) se aktivně účastní tohoto procesu, který řídí stovky genů. (Fausto N 2012 a Michelopoulos 2010) Marabushi et al (2004) navrhli, že akutní zvýšení množství portální krve dodané do zbytkových jater způsobuje poškození střihovým stresem, které vede k produkci oxidu dusnatého (NO), aktivaci vápníkového kanálu a uvolnění VEGF; všechny hrají klíčovou roli při zahájení procesu regenerace. Bucher NL (1964) pozoroval, že hemodynamické změny v portálním průtoku krve přímo souvisí s rozsahem hepatektomie, zvýšení portálního tlaku po 90% hepatektomii je mnohem vyšší než po 70% hepatektomii. Sato et al (1997&1999) znovu potvrdili zjištění Buchera NL a také pozorovali progresivní nárůst portálního tlaku s postupujícím regenerací jater a jeho poklesem směrem k jeho dokončení. Experimentální studie různých výzkumníků jako Wang a Lautt (1998), Cantre D et al (2008,) Schoen JM et al (2001) a Mei Y et al (2011) dále potvrdily roli NO v aktivaci faktorů odpovědných za proliferaci hepatocytů. VEGF uvolněný ze sinusového endotelu je odpovědí na poškození smykovým napětím, které stimuluje HGF (hepatocytový růstový faktor), aby působil na c-met receptory a inicioval proliferaci hepatocytů. (Paranjpe S et al 2007, Borowiak M et al 2004) Portální hypertenze spojená s cirhózou nevede k poškození spojenému se smykovým stresem v důsledku kapilarizace sinusových endoteliálních buněk (SEC) a ztráty sítových desek. (Sato a kol. 1997 & Vollmer a kol. 1998).

Suenaga M (1983) studoval roli portální krve v regeneraci jater po parciální hepatektomii u psů a zjistil, že dostatečné množství portální krve je nezbytné pro regeneraci jater a vysoká koncentrace aminokyselin v portální krvi má pozitivní vliv na proces regenerace. V jiné studii Skov OP et al (1988) zaznamenali, že portální krev obsahuje vysoké množství EGF (epidermální růstový faktor), pankreatických hormonů (inzulin, glukagon) a dalších růstových faktorů, které se aktivně účastní regenerace jater. Bucher NL (1976 a 1977) pozoroval, že jak inzulin, tak glukagon usnadňují regeneraci jater a syntézu DNA po hepatektomii, ale je k tomu zapotřebí nějaký neportální faktor, protože oba nedokázaly vyvolat proliferaci hepatocytů v intaktních játrech, ale mohou vyvolat proliferaci hepatocytů. u hepatektomizovaných a vykuchaných krys. Kromě těchto dvou (inzulínu a glukagonu) se tohoto procesu účastní i další hormony jako růstový hormon, adrenalin, serotonin atd. (Amal ZS et al, 2011; Shi Min Luo, 2004) IL-6 a TNF-α jsou dva faktory, které jsou životně důležité pro zahájení PHLR, portální krev obsahuje faktory odvozené ze střeva, jako jsou lipopolysacharidy, komplementové faktory a intercelulární adhezní molekuly, které aktivují Kupfferovy buňky, aby uvolnily IL-6 a TNF-α, které působí parakrinním způsobem a iniciují regeneraci. (Fausto N 2006, Michelopoulos 2007, Cressman DE a kol. 1996, Feingold KR a kol. 1988, Sudo K a kol. 2008, Yamada Y a kol. 1997, Cornell RP a kol. 1985). Il-6, TNF-α, VEGF, NO iniciují regeneraci aktivací HGF (hepatocyte growth factor), což je silný mitogen hepatocytů. (Diaz JJ a kol. 2011, Cantre D a kol. 2008, Rai RM a kol. 2005). HGF spolu s epidermálním růstovým faktorem (EGF), fibroblastovým růstovým faktorem (FGF), transformujícím růstovým faktorem (TGF), hepatotrofními hormony a několika dalšími známými i neznámými faktory řídí proliferaci a propagaci hepatocytů. (Fausto N 1993, Fausto N a Mead JE 1989).HGF váže Met receptor na hepatocytech a aktivuje jejich růst a proliferaci. (Borowick et al 2004) HGF, EGF a TGF alfa jsou silné mitogeny in vitro, protože mohou indukovat proliferaci hepatocytů v normálních játrech i v nepřítomnosti jiných faktorů a v přítomnosti faktorů, jako jsou cytokiny, mohou stimulovat proliferaci významné části hepatocytů. (Block GD a kol. 1996, Webber EM a kol. 1998) TGF-a může indukovat syntézu DNA a expresi c-myc, když je přidán do kultury hepatocytů potkana. (Skouteris GG a Menamin MM 1992) Zánětlivé mediátory jako Prostaglandin (PGE-2) také hrají určitou roli v regeneraci jater, protože jeho hladina se zvyšuje po hepatektomii u potkanů ​​a tento proces je závislý na c-AMP; bylo zjištěno, že přidání prostaglandinů do kultury hepatocytů o zvyšuje syntézu DNA. (Tsujii H et al, 1993) EGF může stimulovat neonatální potkaní hepatocyt v primární kultuře, aby vstoupil do S a M fáze, kterou lze detekovat již za 4 hodiny a vrcholí mezi 12 až 16 hodinami, poté klesá a tento účinek lze modulovat sérovými faktory a podáváním glukagonu a inzulínu růst dále zesiluje. (Draghi E et al, 1980) HGF má značnou roli v PHLR, po navázání met receptoru aktivuje STAT-3 (převodník signálu a aktivátor transkripce 3), který zprostředkovává indukci genů časné odpovědi a myši s mutantem Met prokázaly zhoršenou regeneraci jater .( Borowiak M et al 2004) Huh CG et al v roce 2004 svou studií na myších s mutantem Met ukázali, že signální dráha HGF/C-Met hraje ústřední roli ve vývoji, regeneraci jater a tumorigenezi. Dráha HGF/Met reguluje expresi mnoha genů souvisejících s buněčným cyklem a apoptózou, včetně p53, cyklinu E a cyklinu B, za účelem podpory buněčného cyklu a inhibice apoptózy během 24 hodin po částečné hepatektomii. (Paranjpe S et al 2007) STAT-3 (převodník signálu a aktivátor-3) je transkripční faktor, který reguluje různé primární geny růstové odpovědi po hepatektomii a může být aktivován různými růstovými faktory a cytokiny.(Li W et al 2002) Vazebná aktivita STAT-3 DNA se zvyšuje ve zbytkových játrech do 30 minut po PH (parciální hepatektomie) a dosahuje 30násobku během 3 hodin a toto zvýšení nenastává po simulované operaci. (Cressman DE et al, 1995) Několik protoonkogenů se také účastní iniciace a dokončení regenerace jater, z nich c-fos, c-jun a c-myc jsou důležité geny. Hladiny transkriptů C-fos a c-jun se v játrech zvýší téměř okamžitě po hepatektomii a vrátí se k normálu do 2 hodin. Toto je následováno zvýšením c-myc mRNA, která dosahuje vrcholu za 2 hodiny a klesá na bazální úroveň za 4 hodiny. (Fausto N et al 1989; Morello D, 1989) V další studii Morello D et al (1990) zjistili, že zvýšení c-myc RNA po hepatektomii je mnohonásobně vyšší než po falešné operaci.

Kromě výše uvedených faktorů se na PHLR přímo nebo nepřímo podílí také několik buněk, jako jsou oválné buňky, makrofágy, krevní destičky a kmenové buňky (CD133+). (Evarts RP et al 1987, Nakamura T et al 1986, Fausto N 2004, Xiang S et al 2012) Ve studii amEsch JS (2012) infuze CD 133+ kmenových buněk zlepšila jaterní rezervu a celkový výsledek po prodloužené hepatektomii. T-buňky mohou také ovlivnit regeneraci jater a myši s deficitem T-buněk a lymfotoxinu mají sníženou schopnost regenerace jater. (Anders SA et al 2005, Tumanov AV et al 2009) Ovální buňky jsou méně citlivé na inhibici TGF-beta, který může významně inhibovat proliferaci zralých hepatocytů, takže tyto buňky (oválné buňky) poskytují alternativní cestu pro regeneraci jater. (Lenanh NN et al 2007) TGF beta je inhibitorem nekontrolované proliferace hepatocytů a exprese TGF beta m RNA dosahuje vrcholu směrem k dokončení buněčného dělení a mitózy, má také inhibiční účinek na aktivitu EGF. (Nquyen LN a kol. 2007, Braun L a kol., 1988, Fausto N a kol. 1990). Ve studii Romera GJ et (2005) myši s knockoutem TGF beta receptoru s heptektomií vykazovaly zvýšenou proliferaci hepatocytů a zvýšený poměr hmoty jater k tělu.

Scotte M et al (1997) studovali expresi cytokinů v játrech po menší a větší hepatektomii u potkanů ​​a zjistili, že TNF a IL-1 se zvyšuje po menší a větší hepatektomii, zatímco IL-6 up-regulace je výraznější po velké (80 %) hepatektomii. Li J et al (2009) porovnávali profil regenerace po velké (2/3) a malé (1/3) hepatektomii u potkanů, profily genové exprese 4, 12 a 30 hodin po hepatektomii vykazovaly podobnou regulaci nahoru a dolů, i když některé geny vykazovaly preferenční expresi po velké hepatektomii. Masson S et al (1999) také studoval vliv rozsahu resekce na regeneraci jater u potkanů ​​a dospěl k závěru, že regenerační odpověď nastává bez ohledu na rozsah hepatektomie, ale průběh regenerace a exprese růstových faktorů se liší podle objemu resekovaných jater. M Nagino et al (2011) pozorovali, že játra se rychle regenerují v prvních dvou týdnech po velké hepatektomii a poté progredují pomalu a zastaví se, když dosáhnou 3/4 původního objemu jater, k čemuž obvykle dochází 6 měsíců až 1 rok po hepatektomii. Také si všimli, že faktory jako rozsah resekce, plocha povrchu těla, resekce portální žíly, emobilizace portální žíly a clearance ICG jsou spojeny s regenerací objemu jater po hepatektomii.