プロバイオティクスのロイテリ菌と口腔微生物叢 (OMICI)

倫理声明 この研究は、スウェーデンのウメオにある地域倫理審査委員会 (Dnr 2011-380-31M) によって承認され、ヘルシンキ宣言で表明された原則に従って実施されました。 書面によるインフォームド コンセントは、すべての参加者から得られました。

被験者と研究デザイン スウェーデンのウメオ大学医学部の学生と従業員のうち、年齢 20 ～ 66 歳の健康な成人ボランティアが、広告を通じて二重盲検ランダム化比較試験 (RCT) に募集されました。 包含基準は、自己申告の健康状態であり、研究の3か月前に抗生物質またはプロバイオティクス製品を使用していませんでした. プロバイオティクス株の持続性に関する以前の研究 [31,32] に基づいて、募集目標は研究グループごとに少なくとも 15 人でした。

タバコ製品を使用していない 44 人のボランティアが募集され、無作為にテスト群 (n = 22) またはプラセボ群 (n = 22; 図 S1) に割り当てられました。 参加者は、1 日 2 個のロゼンジを口の中でゆっくりと溶かし、溶解した錠剤の内容物を口の周りで循環させるよう求められました。 トローチを朝に 1 つ、夕方に 1 つを 12 週間服用しました。 試験トローチには、L. ロイテリ (DSM 17938 および PTA 5289; 株あたり 108 CFU; BioGaia AB、ストックホルム、スウェーデン)、イソマルト、硬化パーム油、ペパーミントおよびメンソール香料、ペパーミント油、およびスクラロース (http://www. biogaia.com/product/biogaia-prodentis-oral-lozenges)。 プラセボ トローチは、乳酸菌を除いて、外観、味、および組成がテスト トローチと同じでした。 コンプライアンスは、割り当てられた合計数の消費されたトローチの割合として監視されました。 この要因を評価するために、毎月の補充のために容器が返却されたときに、残りのロゼンジを数えました。 トローチの残りが 15% 以下の場合、コンプライアンスは許容可能であると見なされました。 参加者は、48時間口腔衛生を控え、サンプリング前の少なくとも4時間は食物を摂取しないように求められました. 参加者はまた、研究期間を通してプロバイオティクス製品を食べないように指示されました.

唾液とバイオフィルムのサンプリング 唾液と歯のバイオフィルムのサンプルは、L. reuteri 補給の直前 (ベースライン) と 4、8、および 12 週間後に得られました (図 S1)。 フォローアップのサンプルは、補給が終了してから 1 か月後と 6 か月後に収集されました。 さらに、1 g のパラフィンを噛むことによって刺激された唾液全体 (約 5 mL) が生成され、氷で冷やした滅菌試験管に集められました。 唾液 1 ミリリットルを培養分析に使用し、残りの唾液を 3,500 × g で 10 分間、4°C で遠心分離しました。 株特異的PCR反応のためのDNA抽出まで、ペレットを-80℃で保存した。 パイロシーケンシング分析では、プールされた歯肉縁上プラークを滅菌爪楊枝で収集し、200 μL の TE バッファー (10 mM Tris、1 mM EDTA、pH 7.6) を含むエッペンドルフ チューブ (Sarstedt、Nümbrecht、ドイツ) に移しました。 サンプルは、DNA抽出まで-80℃で保存されました。

培養および PCR による乳酸桿菌の同定 唾液のアリコートをロゴサ寒天 (メルク、ダルムシュタット、ドイツ) にプレーティングしてラクトバチルス数を取得し、L. ロイテリ (DSM 17938 および PTA 5289) 株の暫定的な同定のために選択寒天にプレーティングしました [33]。 40℃で72時間嫌気的にインキュベートしたL. reuteri PTA 5289を除いて、すべてのプレートを37℃で48～72時間嫌気的にインキュベートした。

記載されているように[34]、唾液ペレットからDNAを抽出した。 L. reuteri DSM 17938 および PTA 5289 特異的 PCR は、KAPA2G Robust HotStart PCR Ready Mix (2x) (Kapa Biosystems、米国マサチューセッツ州ボストン) および株特異的プライマーを使用して同定されました [31]。 簡単に説明すると、2 μL の DNA 抽出物を合計反応量 25 μL (12.5 μL のマスター ミックスと濃度 0.5 μM の各プライマー ペアを含む) に加えました。 PCR条件は95℃で3分間でした。 95°C で 15 秒間、60°C で 15 秒間、72°C で 30 秒間を 40 サイクル。および72°Cで5分間。 PCR 産物は、0.5 × TBE (Tris/Borate/EDTA) 緩衝液、pH 8.3 中、120 V で 80 分間泳動させた 2% アガロースゲルでの電気泳動と、それに続く臭化エチジウム (0.2 µg/µL) 染色によって検証されました。

パイロシーケンシング分析 454 パイロシーケンシング分析では、テスト (n = 8) およびコントロール (n = 8) 被験者から 16 人の被験者がランダムに選択されました (図 S1)。 前述のように、ベースライン、12 週間の暴露、および 1 か月の追跡調査の歯のバイオフィルム サンプルから DNA を抽出しました [34]。 16S rRNA 遺伝子の V3-V4 超可変領域は、フォワード プライマー 347F とリバース プライマー 803R を使用した PCR によって増幅されました [35]。 サンプルの同定のために、実験アンプリコン設計に関するロシュのガイドライン (www.454.com) に従って、これらのプライマーと固有のバーコード配列から融合プライマーを作成しました。 DNA は次の条件で増幅されました。 94℃で 15 秒、58℃で 15 秒、72℃で 30 秒を 30 サイクル。 72ºC で 8 分間の最終伸長。

アンプリコン処理と 454 シーケンスは、Lund University Sequencing Facility (Faculty of Science, Lund, Sweden) で実施されました。 短いフラグメントを除去するためのアンプリコン洗浄 (Agencourt AMPure XP; Beckman Coulter, Brea, CA, USA) および検査 (2100 Bioanalyzer 上の DNA 1000 キット; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) の後、アンプリコンを定量しました (Quant-iT ds DNA アッセイ キット; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA および Quantifluor 蛍光光度計; Promega, Madison, WI, USA) を希釈し、合計 107 コピー/μL を得ました。 滴定およびライブラリ作成 (目標: 10% ～ 15% 濃縮) は、エマルジョン PCR および Lib-A キット (Roche Diagnostics、ブランフォード、コネチカット州、米国) を使用して実行されました。 DNA陽性ビーズを濃縮し、計数し（Innovatis CASY粒子カウンター; Roche Innovatis、ビーレフェルト、ドイツ）、処理し（XLR70シーケンスキット; Roche Diagnostics）、454 Life Sciences Genome Sequencer FLX +マシン（ Roche Applied Sciences;ペンツベルグ、ドイツ）。

データ処理 被験者の特性、コンプライアンス、および培養データは、SPSS (バージョン 22.0; IBM Corporation、米国ニューヨーク州アーモンク) を使用して処理されました。 平均 [95% 信頼区間 (CI)] や比率分布などの記述統計量が計算されました。 グループ間の違いは、データ測定と分布レベルに応じて、パラメトリック検定またはノンパラメトリック検定でテストされました。 P < 0.05 は統計的に有意と見なされました。

プライマー配列除去後の最小長 300 塩基対、正しいバーコード配列、プライマー配列内の最大 1 つの不適切な塩基対、および Quantitative Insights into Microbial Ecology のホモポリマーおよび品質スコアのデフォルトの品質基準への準拠 ( QIIME) [36] ソフトウェア パッケージ (バージョン 1.8.0) は分析のために保持されました。 リバースプライマーを超える配列はすべて削除されました。 リバース プライマーで始まる配列は逆に補完されました。 次に、配列は、USEARCH [38] を使用して、16S rRNA キメラでチェックされた Greengene データベース (2013 年 5 月日付) [37] で 97% の配列類似性で操作上の分類単位 (OTU) にクラスター化されました。 単一のシーケンスを持つ OTU は削除されました。 残りの OTU あたり 1 つの代表的な配列は、HOMD 16S rRNA RefSeq、バージョン 12.0 (http://www.homd.org) を使用して、98.5% 以上の同一性で、名前付きまたは名前なしの栽培可能な種または栽培不可能なファイロタイプとして分類学的に割り当てられました。 [28]。

希薄化曲線は、微生物の豊富さを比較するために計算されました [39]。 主座標分析 (PCoA) を適用して、さまざまな時点での細菌プロファイルの系統発生ベータ多様性 [40] を評価しました。 多変量部分最小二乗分析 (PLS) モデリング (SIMCA P+、バージョン 12.0; Umetrics AB、Umeå、スウェーデン) を実行して、微生物叢の構造が L. reuteri の消費 (y 変数) に関連しているかどうかを調べました [41,42]。 テストされたモデルには、パイロシーケンシング データのみのモデルと、乳酸菌と連鎖球菌の培養および PCR データが追加されたモデルが含まれていました。 変数は単位分散に自動スケーリングされ、交差検証された Y 予測が計算されました。 サブジェクト クラスタリングはスコア ローディング プロットに表示され、各 x 変数の重要性はローディング プロットに表示されました。 PLS 相関係数の 95% CI がゼロを含まない変数は、統計的に有意であると見なされました [42]。 第 2 四半期の値は、結果を予測するための x 変数の能力を示しました (テストまたはプラセボ グループの割り当て)。 単一の分類群の単変量解析は、小グループの組み合わせと多数の反復テストのために適用されませんでした。