Probiotische Lactobacillus Reuteri en orale microbiota (OMICI)

Ethische verklaringen De studie werd goedgekeurd door de Regionale Ethische Beoordelingscommissie in Umeå, Zweden (Dnr 2011-380-31M) en werd uitgevoerd volgens de principes die zijn uitgedrukt in de Verklaring van Helsinki. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers.

Onderwerpen en onderzoeksopzet Gezonde volwassen vrijwilligers in de leeftijd van 20-66 jaar, onder studenten en medewerkers van de Faculteit der Geneeskunde, Universiteit van Umeå, Zweden, werden via advertenties gerekruteerd voor een dubbelblinde, gerandomiseerde gecontroleerde studie (RCT). Inclusiecriteria waren een zelfgerapporteerde gezonde status en geen gebruik van antibiotica of probiotische producten gedurende 3 maanden voorafgaand aan het onderzoek. Op basis van eerdere studies met betrekking tot de persistentie van probiotische stammen [31,32], was het rekruteringsdoel ten minste 15 mensen per onderzoeksgroep.

Vierenveertig vrijwilligers, die geen van allen tabaksproducten gebruikten, werden gerekruteerd en willekeurig toegewezen aan een testgroep (n = 22) of een placebogroep (n = 22; figuur S1). Deelnemers werd gevraagd om 2 zuigtabletten per dag langzaam in de mond te laten smelten en de opgeloste tabletinhoud rond hun mond te laten circuleren. Gedurende 12 weken werd één zuigtablet 's ochtends en één 's avonds ingenomen. De testtabletten bevatten L. reuteri (DSM 17938 en PTA 5289; 108 CFU per stam; BioGaia AB, Stockholm, Zweden), isomalt, gehydrogeneerde palmolie, pepermunt- en mentholaroma, pepermuntolie en sucralose (//www. biogaia.com/product/biogaia-prodentis-orale-zuigtabletten). De placebo-zuigtabletten waren qua uiterlijk, smaak en samenstelling identiek aan de test-zuigtabletten, met uitzondering van de lactobacillen. Naleving werd gecontroleerd als het percentage geconsumeerde zuigtabletten van het totale toegewezen aantal. De resterende zuigtabletten werden geteld toen de containers werden geretourneerd voor maandelijkse vullingen om deze factor te beoordelen. Naleving werd als acceptabel beschouwd als er ≤15% van de zuigtabletten overbleef. Deelnemers werd gevraagd om zich gedurende 48 uur te onthouden van mondhygiëne en om gedurende ten minste 4 uur vóór de bemonstering geen voedsel te consumeren. Deelnemers kregen ook de instructie om tijdens de onderzoeksperiode geen probiotische producten te eten.

Speeksel- en biofilmmonsters Speeksel- en tandbiofilmmonsters werden verkregen onmiddellijk vóór (basislijn) en na 4, 8 en 12 weken L. reuteri-suppletie (Figuur S1). Vervolgmonsters werden verzameld 1 en 6 maanden nadat de suppletie was beëindigd. Bovendien werd volledig gestimuleerd speeksel (~ 5 ml) gegenereerd door 1 g paraffine te kauwen en te verzamelen in met ijs gekoelde steriele reageerbuizen. Eén milliliter speeksel werd gebruikt voor culturele analyse en het resterende speeksel werd gedurende 10 minuten bij 4°C bij 3.500 x g gecentrifugeerd. De pellets werden bewaard bij -80°C tot DNA-extractie voor stamspecifieke PCR-reacties. Voor de pyrosequencing-analyse werd gepoolde supragingivale plaque verzameld met gesteriliseerde tandenstokers en overgebracht naar Eppendorf-buisjes (Sarstedt, Nümbrecht, Duitsland) die 200 µl TE-buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6) bevatten. De monsters werden bewaard bij -80°C tot DNA-extractie.

Identificatie van lactobacilli door kweek en PCR Monsters van speeksel werden uitgeplaat op Rogosa-agar (Merck, Darmstadt, Duitsland) om Lactobacillus-tellingen te verkrijgen en op selectieve agar voor voorlopige identificatie van de L. reuteri-stammen (DSM 17938 en PTA 5289) [33]. Alle platen werden anaëroob geïncubeerd bij 37°C gedurende 48-72 uur, behalve L. reuteri PTA 5289, die 72 uur anaëroob werd geïncubeerd bij 40°C.

DNA werd geëxtraheerd uit speekselpellets zoals beschreven [34]. L. reuteri DSM 17938 en PTA 5289-specifieke PCR werden geïdentificeerd met behulp van KAPA2G Robust HotStart PCR Ready Mix (2×) (Kapa Biosystems, Boston, MA, VS) en stamspecifieke primers [31]. In het kort werd 2 µl DNA-extract toegevoegd aan een totaal reactievolume van 25 µl (bevattende 12,5 µl mastermix en elk primerpaar in een concentratie van 0,5 µM). PCR-omstandigheden waren 95°C gedurende 3 minuten; 40 cycli van 95 °C gedurende 15 seconden, 60 °C gedurende 15 seconden en 72 °C gedurende 30 seconden; en 72°C gedurende 5 min. PCR-producten werden vervolgens geverifieerd door middel van elektroforese op 2% agarosegels die gedurende 80 minuten bij 120 V in 0,5 x TBE (Tris/Borate/EDTA)-buffer, pH 8,3, mochten lopen, gevolgd door kleuring met ethidiumbromide (0,2 µg/µL).

Pyrosequencing-analyse Voor de 454 pyrosequencing-analyse werden 16 proefpersonen willekeurig geselecteerd uit de test (n = 8) en controle (n = 8) proefpersonen (Figuur S1). DNA werd geëxtraheerd uit de basislijn, 12 weken durende blootstelling en 1 maand follow-up biofilmmonsters van tanden, zoals eerder beschreven [34]. Het hypervariabele V3-V4-gebied van het 16S-rRNA-gen werd geamplificeerd via PCR met behulp van de voorwaartse primer 347F en de omgekeerde primer 803R [35]. Voor monsteridentificatie werden fusieprimers gemaakt van deze primers en unieke streepjescodesequenties volgens de Roche-richtlijnen voor experimenteel ampliconontwerp (www.454.com). DNA werd geamplificeerd onder de volgende loopomstandigheden: initiële denaturatie bij 94°C gedurende 3 min; 30 cycli van 94ºC gedurende 15 s, 58ºC gedurende 15 s en 72ºC gedurende 30 s; en een laatste verlenging bij 72°C gedurende 8 min.

Amplicon-verwerking en 454-sequencing werden uitgevoerd bij de Lund University Sequencing Facility (Faculty of Science, Lund, Zweden). Na amplicon-reiniging om korte fragmenten te verwijderen (Agencourt AMPure XP; Beckman Coulter, Brea, CA, VS) en inspectie (DNA 1000-kit op een 2100 Bioanalyzer; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, VS), werden amplicons gekwantificeerd (Quant-iT ds DNA-assaykit; Invitrogen, Carlsbad, CA, VS en Quantifluor fluorometer; Promega, Madison, WI, VS) en verdund om in totaal 107 kopieën/μL te verkrijgen. Titratie en bibliotheekproductie (doel: 10% -15% verrijking) werden uitgevoerd met behulp van emulsie-PCR en de Lib-A-kit (Roche Diagnostics, Branford, CT, VS). DNA-positieve kralen werden verrijkt, geteld (Innovatis CASY-deeltjesteller; Roche Innovatis, Bielefeld, Duitsland), verwerkt (XLR70-sequencingkit; Roche Diagnostics) en geladen op een picotiterplaat voor pyrosequencing op een 454 Life Sciences Genome Sequencer FLX + -machine ( Roche Toegepaste Wetenschappen; Penzberg, Duitsland).

Gegevensverwerking Persoonskenmerk-, nalevings- en cultuurgegevens werden verwerkt met behulp van SPSS (versie 22.0; IBM Corporation, Armonk, NY, VS). Beschrijvende statistieken, zoals gemiddelden [95% betrouwbaarheidsintervallen (BI)] en proportieverdelingen werden berekend. Verschillen tussen groepen werden getest met parametrische of niet-parametrische tests, afhankelijk van de gegevensmeting en distributieniveaus. P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Sequenties met een minimale lengte van 300 basenparen na verwijdering van de primersequentie, correcte barcodesequenties, maximaal 1 fout basenpaar in de primersequenties, en voldoen aan de standaard kwaliteitscriteria voor homopolymeren en kwaliteitsscores in de Quantitative Insights into Microbial Ecology ( QIIME) [36] softwarepakket (versie 1.8.0) werden bewaard voor analyse. Elke sequentie voorbij de omgekeerde primer werd verwijderd. Sequenties die beginnen met de reverse primer werden reverse gecomplementeerd. Sequenties werden vervolgens geclusterd in operationele taxonomische eenheden (OTU's) met een sequentie-overeenkomst van 97% in de 16S rRNA-chimera-gecontroleerde Greengene-database (gedateerd mei 2013) [37] met behulp van USEARCH [38]. OTU's met een enkele reeks zijn verwijderd. Eén representatieve sequentie per resterende OTU werd taxonomisch toegewezen als een benoemde of naamloze cultiveerbare soort of niet-cultiveerbaar phylotype bij ≥98,5% identiteit met behulp van HOMD 16S rRNA RefSeq, versie 12.0 (//www.homd.org) [28].

Verdunningscurven werden berekend om de microbiële rijkdom te vergelijken [39]. Principale coördinatenanalyse (PCoA) werd toegepast om de fylogenetische bèta-diversiteit [40] van de bacterieprofielen op verschillende tijdstippen te evalueren. Multivariate partiële kleinste-kwadratenanalyse (PLS)-modellering (SIMCA P+, versie 12.0; Umetrics AB, Umeå, Zweden) werd uitgevoerd om te zoeken of microbiota-structuren gerelateerd waren aan L. reuteri-consumptie (y-variabelen) [41,42]. Geteste modellen omvatten modellen met alleen pyrosequencinggegevens en modellen waaraan lactobacillen- en streptokokkenkweek- en PCR-gegevens waren toegevoegd. Variabelen werden automatisch geschaald naar eenheidsvariantie en cross-gevalideerde Y-voorspellingen werden berekend. Onderwerpclustering werd weergegeven in scorelaadplots en het belang van elke x-variabele werd weergegeven in laadplots. Variabelen waarbij het 95%-BI van de PLS-correlatiecoëfficiënt geen nul omvatte, werden als statistisch significant beschouwd [42]. De Q2-waarde leverde de capaciteiten op van de x-variabelen om de uitkomst te voorspellen (toewijzing van test- of placebogroep). Univariate analyses van enkele taxa werden niet toegepast vanwege de combinatie van kleine groepen en een groot aantal herhaalde tests.