Probiotikum Lactobacillus Reuteri a orální mikrobiota (OMICI)

Etická prohlášení Studie byla schválena Regionální radou pro etické hodnocení v Umeå ve Švédsku (Dnr 2011-380-31M) a byla provedena podle zásad vyjádřených v Helsinské deklaraci. Od všech účastníků byl získán písemný informovaný souhlas.

Předměty a design studie Zdraví dospělí dobrovolníci ve věku 20–66 let mezi studenty a zaměstnanci Lékařské fakulty Univerzity Umeå ve Švédsku byli prostřednictvím inzerátů přijati do dvojitě zaslepené, randomizované kontrolované studie (RCT). Kritériem pro zařazení byl zdravý stav, který si sami uvedli, a žádné užívání antibiotik nebo probiotických produktů během 3 měsíců před studií. Na základě předchozích studií týkajících se perzistence probiotických kmenů [31,32] bylo cílem náboru alespoň 15 osob na studijní skupinu.

Bylo vybráno 44 dobrovolníků, z nichž žádný neužíval tabákové výrobky, a náhodně rozděleni buď do testovací (n = 22) nebo do skupiny s placebem (n = 22; obrázek S1). Účastníci byli požádáni, aby nechali 2 pastilky denně pomalu rozpustit v ústech a nechat cirkulovat rozpuštěný obsah tablet kolem jejich úst. Jedna pastilka se užívala ráno a 1 večer po dobu 12 týdnů. Testované pastilky obsahovaly L. reuteri (DSM 17938 a PTA 5289; 108 CFU na kmen; BioGaia AB, Stockholm, Švédsko), isomalt, hydrogenovaný palmový olej, mátovou a mentolovou příchuť, mátový olej a sukralózu (http://www. biogaia.com/product/biogaia-prodentis-oral-lozenges). Pastilky s placebem byly identické s testovanými pastilkami vzhledem, chutí a složením kromě laktobacilů. Shoda byla monitorována jako procento zkonzumovaných pastilek z celkového přiděleného počtu. Zbývající pastilky byly spočítány, když byly nádoby vráceny k měsíčnímu doplňování, aby se vyhodnotil tento faktor. Vyhovění bylo považováno za přijatelné, pokud zůstalo ≤ 15 % pastilek. Účastníci byli požádáni, aby se zdrželi ústní hygieny po dobu 48 hodin a nekonzumovali žádné jídlo alespoň 4 hodiny před odběrem vzorků. Účastníci byli také instruováni, aby nejedli probiotické produkty po celou dobu studie.

Vzorky slin a biofilmu Vzorky slin a biofilmu zubů byly odebrány bezprostředně před (základní hodnota) a po 4, 8 a 12 týdnech suplementace L. reuteri (obrázek S1). Následné vzorky byly odebrány 1 a 6 měsíců po ukončení suplementace. Kromě toho byly celé stimulované sliny (~5 ml) vytvořeny žvýkáním 1 g parafínu a shromážděny do ledem chlazených sterilních zkumavek. Jeden mililitr slin byl použit pro kultivaci a zbývající sliny byly centrifugovány při 3500 x g po dobu 10 minut při 4 °C. Pelety byly skladovány při -80 °C až do extrakce DNA pro kmenově specifické PCR reakce. Pro pyrosekvenační analýzu byl shromážděný supragingivální plak odebrán sterilizovanými párátky a přenesen do Eppendorfových zkumavek (Sarstedt, Nümbrecht, Německo) obsahujících 200 ul TE-pufru (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6). Vzorky byly skladovány při -80 °C až do extrakce DNA.

Identifikace laktobacilů kulturou a PCR Alikvoty slin byly naneseny na agar Rogosa (Merck, Darmstadt, Německo), aby se získal počet Lactobacillus, a na selektivní agar pro předběžnou identifikaci kmenů L. reuteri (DSM 17938 a PTA 5289) [33]. Všechny plotny byly anaerobně inkubovány při 37 °C po dobu 48-72 hodin, kromě L. reuteri PTA 5289, který byl anaerobně inkubován při 40 °C po dobu 72 hodin.

DNA byla extrahována z pelet slin, jak je popsáno [34]. L. reuteri DSM 17938 a PTA 5289-specifické PCR byly identifikovány pomocí KAPA2G Robust HotStart PCR Ready Mix (2×) (Kapa Biosystems, Boston, MA, USA) a kmenově specifických primerů [31]. Stručně, 2 ul DNA extraktu byly přidány do celkového reakčního objemu 25 ul (obsahujícího 12,5 ul master mixu a každého páru primerů v koncentraci 0,5 uM). Podmínky PCR byly 95 °C po dobu 3 minut; 40 cyklů 95 °C po dobu 15 s, 60 °C po dobu 15 s a 72 °C po dobu 30 s; a 72 °C po dobu 5 minut. Produkty PCR byly poté ověřeny elektroforézou na 2% agarózových gelech, které byly ponechány běžet 80 minut při 120 V v 0,5x TBE (Tris/Borát/EDTA) pufru, pH 8,3, s následným barvením ethidium bromidem (0,2 ug/ul).

Pyrosekvenační analýza Pro 454 pyrosekvenační analýzu bylo náhodně vybráno 16 subjektů z testovaných (n = 8) a kontrolních (n = 8) subjektů (obrázek S1). DNA byla extrahována z výchozích vzorků, 12týdenní expozice a 1měsíčního sledování vzorků zubního biofilmu, jak bylo popsáno dříve [34]. Hypervariabilní oblast V3-V4 genu 16S rRNA byla amplifikována pomocí PCR s použitím přímého primeru 347F a reverzního primeru 803R [35]. Pro identifikaci vzorku byly z těchto primerů a jedinečných sekvencí čárových kódů vytvořeny fúzní primery podle pokynů společnosti Roche pro návrh experimentálního amplikonu (www.454.com). DNA byla amplifikována za následujících provozních podmínek: počáteční denaturace při 94 °C po dobu 3 minut; 30 cyklů 94 °C po dobu 15 s, 58 °C po dobu 15 s a 72 °C po dobu 30 s; a konečné prodloužení při 72 °C po dobu 8 minut.

Zpracování amplikonu a 454 sekvenování byly provedeny v sekvenačním zařízení univerzity v Lundu (Přírodovědecká fakulta, Lund, Švédsko). Po vyčištění amplikonu za účelem odstranění krátkých fragmentů (Agencourt AMPure XP; Beckman Coulter, Brea, CA, USA) a kontrole (souprava DNA 1000 na bioanalyzátoru 2100; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) byly amplikony kvantifikovány (Quant-iT ds DNA assay kit; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA a fluorometr Quantifluor; Promega, Madison, WI, USA) a zředěny tak, aby bylo získáno celkem 107 kopií/μl. Titrace a produkce knihovny (cíl: 10%-15% obohacení) byly provedeny pomocí emulzní PCR a soupravy Lib-A (Roche Diagnostics, Branford, CT, USA). DNA-pozitivní kuličky byly obohaceny, spočítány (počítač částic Innovatis CASY; Roche Innovatis, Bielefeld, Německo), zpracovány (sekvenační souprava XLR70; Roche Diagnostics) a vloženy na pikotitrační destičku pro pyrosekvenování na stroji 454 Life Sciences Genome Sequencer FLX+ ( Roche Applied Sciences, Penzberg, Německo).

Zpracování dat Údaje o charakteristikách subjektu, shodě a kultuře byly zpracovány pomocí SPSS (verze 22.0; IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Byly vypočteny popisné statistiky, jako jsou průměry [95% intervaly spolehlivosti (CI)] a podílové distribuce. Rozdíly mezi skupinami byly testovány parametrickými nebo neparametrickými testy v závislosti na úrovni měření a distribuce dat. P < 0,05 bylo považováno za statisticky významné.

Sekvence s minimální délkou 300 párů bází po odstranění sekvence primeru, správné sekvence čárového kódu, maximálně 1 nesprávný pár bází v sekvencích primerů a soulad s výchozími kritérii kvality pro homopolymery a skóre kvality v Quantitative Insights into Microbial Ecology ( QIIME) [36] softwarový balík (verze 1.8.0) byly ponechány pro analýzu. Jakákoli sekvence za reverzním primerem byla odstraněna. Sekvence začínající reverzním primerem byly reverzně doplněny. Sekvence byly poté seskupeny do operačních taxonomických jednotek (OTU) se sekvenční podobností 97 % v databázi Greengene kontrolované chimérou 16S rRNA (z května 2013) [37] pomocí USEARCH [38]. OTU s jedinou sekvencí byly odstraněny. Jedna reprezentativní sekvence na zbývající OTU byla taxonomicky přiřazena jako pojmenovaný nebo nepojmenovaný kultivovatelný druh nebo nekultivovatelný fylotyp s ≥98,5% identitou pomocí HOMD 16S rRNA RefSeq, verze 12.0 (http://www.homd.org) [28].

Pro srovnání mikrobiálního bohatství byly vypočteny vzácné křivky [39]. K hodnocení fylogenetické beta diverzity [40] bakteriálních profilů v různých časových bodech byla použita hlavní souřadnicová analýza (PCoA). Bylo provedeno modelování multivariační parciální analýzy nejmenších čtverců (PLS) (SIMCA P+, verze 12.0; Umetrics AB, Umeå, Švédsko), aby se zjistilo, zda struktury mikrobioty souvisejí s konzumací L. reuteri (proměnné y) [41,42]. Testované modely zahrnovaly modely s pouze pyrosekvenačními daty a modely, ke kterým byla přidána kultivace laktobacilů a streptokoků a data PCR. Proměnné byly automaticky škálovány na jednotkový rozptyl a byly vypočteny křížově validované Y predikce. Shlukování subjektů bylo zobrazeno v grafech zatížení skóre a důležitost každé x-proměnné byla zobrazena v grafech zatížení. Za statisticky významné byly považovány proměnné, kde 95% CI korelačního koeficientu PLS nezahrnoval nulu [42]. Hodnota Q2 poskytla schopnosti x-proměnných předpovídat výsledek (rozdělení do testovaných nebo placebových skupin). Jednorozměrné analýzy jednotlivých taxonů nebyly použity z důvodu kombinace malých skupin a vysokého počtu opakovaných testů.