Probiotic Lactobacillus Reuteri 및 구강 미생물군 (OMICI)

윤리 선언문 이 연구는 스웨덴 Umeå에 있는 지역 윤리 검토 위원회(Dnr 2011-380-31M)의 승인을 받았으며 헬싱키 선언에 명시된 원칙에 따라 수행되었습니다. 모든 참가자로부터 서면 동의서를 얻었습니다.

주제 및 연구 설계 스웨덴 Umeå 대학교 의과대학의 학생과 직원 중 20-66세의 건강한 성인 지원자를 광고를 통해 이중 맹검, 무작위 대조 시험(RCT)에 모집했습니다. 포함 기준은 자가 보고된 건강 상태 및 연구 전 3개월 동안 항생제 또는 프로바이오틱 제품을 사용하지 않은 것이었다. 프로바이오틱스 균주의 지속성에 관한 이전 연구[31,32]에 따르면 모집 목표는 연구 그룹당 최소 15명이었습니다.

담배 제품을 사용하지 않은 44명의 지원자를 모집하여 테스트(n = 22) 또는 위약 그룹(n = 22; 그림 S1)에 무작위로 할당했습니다. 참가자들은 하루에 2개의 마름모꼴을 입에서 천천히 녹이고 용해된 정제 내용물을 입 주위로 순환하도록 요청했습니다. 12주 동안 아침에 1정, 저녁에 1정을 복용했습니다. 테스트 사탕은 L. reuteri(DSM 17938 및 PTA 5289; 균주당 108 CFU; BioGaia AB, 스웨덴 스톡홀름), 이소말트, 경화 팜유, 페퍼민트 및 멘톨 향료, 페퍼민트 오일 및 수크랄로스(http://www. biogaia.com/product/biogaia-prodentis-oral-lozenges). 위약 사탕은 유산균을 제외하고 외관, 맛 및 구성이 시험용 사탕과 동일했습니다. 순응도는 할당된 총 수 중 소비된 마름모꼴의 백분율로 모니터링되었습니다. 이 요소를 평가하기 위해 월별 리필을 위해 용기를 반환할 때 나머지 마름모꼴을 세었습니다. 마름모꼴의 ≤15%가 남아 있으면 준수가 허용되는 것으로 간주되었습니다. 참가자들은 48시간 동안 구강 위생을 삼가하고 샘플링 전 최소 4시간 동안 음식을 섭취하지 않도록 요청받았습니다. 참가자들은 또한 연구 기간 내내 프로바이오틱스 제품을 먹지 않도록 지시 받았습니다.

타액 및 생물막 샘플링 타액 및 치아 생물막 샘플은 L. reuteri 보충 직전(기준선)과 4, 8 및 12주 후에 얻었습니다(그림 S1). 추적 샘플은 보충이 종료된 후 1개월 및 6개월 후에 수집되었습니다. 또한 파라핀 1g을 씹어 전체 자극 타액(~5mL)을 생성하고 얼음으로 냉각된 멸균 시험관에 수집했습니다. 타액 1ml를 배양 분석에 사용하였고, 나머지 타액은 4℃에서 10분간 3,500×g로 원심분리하였다. 펠렛은 균주 특이적 PCR 반응을 위한 DNA 추출까지 -80°C에서 보관되었습니다. 파이로시퀀싱 분석을 위해 풀링된 치은연상 플라크를 멸균된 이쑤시개로 수집하고 200 μL의 TE-버퍼(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 7.6)가 들어 있는 Eppendorf 튜브(Sarstedt, Nümbrecht, Germany)로 옮겼습니다. 샘플은 DNA 추출 전까지 -80°C에서 보관되었습니다.

배양 및 PCR에 의한 락토바실러스의 동정 침의 분취량을 Rogosa 한천(Merck, Darmstadt, Germany)에 도말하여 Lactobacillus 수를 얻었고 L. reuteri(DSM 17938 및 PTA 5289) 균주의 잠정적 동정을 위한 선택적 한천에 도말했습니다[33]. 40℃에서 72시간 동안 혐기적으로 배양된 L. reuteri PTA 5289를 제외하고 모든 플레이트를 37℃에서 48-72시간 동안 혐기적으로 배양하였다.

[34]에 설명된 대로 타액 알갱이에서 DNA를 추출했습니다. L. reuteri DSM 17938 및 PTA 5289 특이적 PCR은 KAPA2G Robust HotStart PCR Ready Mix(2x)(Kapa Biosystems, Boston, MA, USA) 및 균주 특이적 프라이머[31]를 사용하여 확인되었습니다. 간단히 말해, 2μL의 DNA 추출물을 총 반응 부피 25μL(12.5μL의 마스터 믹스와 0.5μM 농도의 각 프라이머 쌍 포함)에 첨가했습니다. PCR 조건은 95°C에서 3분 동안; 95°C에서 15초, 60°C에서 15초, 72°C에서 30초의 40주기; 및 72°C에서 5분 동안. 그런 다음 PCR 산물을 0.5x TBE(Tris/Borate/EDTA) 완충액, pH 8.3에서 120V에서 80분 동안 작동시킨 2% 아가로스 겔에서 전기영동한 다음 ethidium bromide(0.2μg/μL) 염색으로 확인했습니다.

파이로시퀀싱 분석 454 파이로시퀀싱 분석을 위해 테스트(n = 8) 및 대조군(n = 8) 피험자 중에서 16명의 피험자를 무작위로 선택했습니다(그림 S1). 이전에 설명한 대로 기준선, 12주 노출 및 1개월 후속 치아 바이오필름 샘플에서 DNA를 추출했습니다[34]. 16S rRNA 유전자의 V3-V4 초가변 영역은 정방향 프라이머 347F 및 역방향 프라이머 803R을 사용하여 PCR을 통해 증폭되었습니다[35]. 샘플 식별을 위해 실험적 앰플리콘 설계를 위한 Roche 지침(www.454.com)에 따라 이러한 프라이머와 고유한 바코드 시퀀스로부터 퓨전 프라이머를 생성했습니다. DNA는 다음 실행 조건에서 증폭되었습니다: 94°C에서 3분 동안 초기 변성; 15초 동안 94ºC, 15초 동안 58ºC, 30초 동안 72ºC의 30주기; 72ºC에서 8분 동안 최종 연장.

Amplicon 처리 및 454 시퀀싱은 Lund University Sequencing Facility(Faculty of Science, Lund, Sweden)에서 수행되었습니다. 짧은 조각을 제거하기 위한 앰플리콘 세척(Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter, Brea, CA, USA) 및 검사(2100 Bioanalyzer의 DNA 1000 키트, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) 후, 앰플리콘을 정량화했습니다(Quant-iT ds DNA assay kit; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA 및 Quantifluor fluorometer; Promega, Madison, WI, USA) 및 희석하여 총 107 copies/μL를 얻습니다. 적정 및 라이브러리 생산(목표: 10%-15% 농축)은 에멀젼 PCR 및 Lib-A 키트(Roche Diagnostics, Branford, CT, USA)를 사용하여 수행되었습니다. DNA-양성 비드를 농축하고, 계수하고(Innovatis CASY 입자 계수기, Roche Innovatis, Bielefeld, Germany), 처리하고(XLR70 시퀀싱 키트, Roche Diagnostics), 454 Life Sciences Genome Sequencer FLX+ 기계에서 파이로시퀀싱을 위해 피코타이터 플레이트에 로드했습니다. Roche Applied Sciences, 독일 Penzberg).

데이터 처리 주제 특성, 준수 및 문화 데이터는 SPSS(버전 22.0; IBM Corporation, Armonk, NY, USA)를 사용하여 처리되었습니다. 평균[95% 신뢰 구간(CI)] 및 비율 분포와 같은 기술 통계가 계산되었습니다. 그룹 간의 차이는 데이터 측정 및 분포 수준에 따라 모수 또는 비모수 테스트로 테스트되었습니다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

프라이머 서열 제거 후 최소 300개 염기쌍 길이의 서열, 올바른 바코드 서열, 프라이머 서열에서 최대 1개의 부정확한 염기쌍, 및 Quantitative Insights into Microbial Ecology의 동종중합체 및 품질 점수에 대한 기본 품질 기준 준수( QIIME) [36] 소프트웨어 패키지(버전 1.8.0)는 분석을 위해 보관되었습니다. 역방향 프라이머 이외의 모든 서열이 제거되었습니다. 역방향 프라이머로 시작하는 서열은 역방향으로 보완되었습니다. 그런 다음 시퀀스는 USEARCH [38]를 사용하여 16S rRNA 키메라 확인 Greengene 데이터베이스(2013년 5월 날짜)[37]에서 97%의 시퀀스 유사성으로 OTU(Operational Taxonomic Unit)로 클러스터링되었습니다. 단일 시퀀스의 OTU가 제거되었습니다. 남은 OTU 당 하나의 대표적인 서열은 HOMD 16S rRNA RefSeq, 버전 12.0(http://www.homd.org)을 사용하여 ≥98.5% 동일성에서 명명되거나 명명되지 않은 재배 가능한 종 또는 재배 불가능한 계통형으로 분류학적으로 지정되었습니다. [28].

희박화 곡선은 미생물 풍부도를 비교하기 위해 계산되었습니다[39]. PCoA(Principal Coordinate Analysis)를 적용하여 서로 다른 시점에서 박테리아 프로필의 계통발생적 베타 다양성[40]을 평가했습니다. 다변량 부분 최소 자승 분석(PLS) 모델링(SIMCA P+, 버전 12.0; Umetrics AB, Umeå, Sweden)을 수행하여 미생물군 구조가 L. reuteri 소비(y-변수)와 관련이 있는지 검색했습니다[41,42]. 테스트 대상 모델에는 파이로시퀀싱 데이터만 있는 모델과 유산균 및 연쇄상구균 배양 및 PCR 데이터가 추가된 모델이 포함되었습니다. 변수는 단위 분산으로 자동 조정되었으며 교차 검증된 Y 예측이 계산되었습니다. 주제 클러스터링은 점수 로딩 플롯에 표시되었으며 각 x-변수의 중요성은 로딩 플롯에 표시되었습니다. PLS 상관계수의 95% CI가 0을 포함하지 않는 변수는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다[42]. Q2 값은 결과(테스트 또는 위약 그룹 할당)를 예측하기 위한 x-변수의 용량을 산출했습니다. 소규모 그룹의 조합과 많은 반복 테스트로 인해 단일 분류군에 대한 단 변량 분석은 적용되지 않았습니다.