Probiotico Lactobacillus Reuteri e microbiota orale (OMICI)

Dichiarazioni etiche Lo studio è stato approvato dal Regional Ethical Review Board di Umeå, Svezia (Dnr 2011-380-31M) ed è stato condotto secondo i principi espressi nella Dichiarazione di Helsinki. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti.

Soggetti e disegno dello studio Volontari adulti sani, di età compresa tra 20 e 66 anni, tra studenti e dipendenti della Facoltà di Medicina dell'Università di Umeå, in Svezia, sono stati reclutati per uno studio controllato randomizzato in doppio cieco (RCT) tramite pubblicità. I criteri di inclusione erano uno stato di salute auto-riferito e nessun uso di antibiotici o prodotti probiotici nei 3 mesi precedenti lo studio. Sulla base di studi precedenti sulla persistenza dei ceppi probiotici [31,32], l'obiettivo di reclutamento era di almeno 15 persone per gruppo di studio.

Quarantaquattro volontari, nessuno dei quali utilizzava prodotti del tabacco, sono stati reclutati e assegnati in modo casuale a un gruppo di test (n = 22) o placebo (n = 22; Figura S1). Ai partecipanti è stato chiesto di consentire a 2 pastiglie al giorno di sciogliersi lentamente in bocca e di far circolare il contenuto della compressa disciolto intorno alla bocca. Una pastiglia è stata assunta al mattino e 1 alla sera per 12 settimane. Le pastiglie di prova contenevano L. reuteri (DSM 17938 e PTA 5289; 108 CFU per ceppo; BioGaia AB, Stoccolma, Svezia), isomalto, olio di palma idrogenato, aroma di menta piperita e mentolo, olio di menta piperita e sucralosio (http://www. biogaia.com/product/biogaia-prodentis-oral-lozenges). Le pastiglie placebo erano identiche alle pastiglie di prova nell'aspetto, nel gusto e nella composizione, ad eccezione dei lattobacilli. La conformità è stata monitorata come percentuale di pastiglie consumate rispetto al numero totale assegnato. Le pastiglie rimanenti sono state contate quando i contenitori sono stati restituiti per le ricariche mensili per valutare questo fattore. La conformità è stata considerata accettabile se rimaneva ≤15% delle losanghe. Ai partecipanti è stato chiesto di astenersi dall'igiene orale per 48 ore e di non consumare cibo per almeno 4 ore prima del campionamento. I partecipanti sono stati anche istruiti a non mangiare prodotti probiotici durante il periodo di studio.

Campionamento di saliva e biofilm I campioni di saliva e biofilm dei denti sono stati ottenuti immediatamente prima (basale) e dopo 4, 8 e 12 settimane di integrazione con L. reuteri (Figura S1). I campioni di follow-up sono stati raccolti 1 e 6 mesi dopo la fine dell'integrazione. Inoltre, l'intera saliva stimolata (~ 5 mL) è stata generata masticando 1 g di paraffina e raccolta in provette sterili raffreddate con ghiaccio. Un millilitro di saliva è stato utilizzato per l'analisi colturale e la saliva rimanente è stata centrifugata a 3.500 × g per 10 minuti a 4°C. I pellet sono stati conservati a -80°C fino all'estrazione del DNA per le reazioni PCR ceppo-specifiche. Per l'analisi del pirosequenziamento, la placca sopragengivale raggruppata è stata raccolta con stuzzicadenti sterilizzati e trasferita in provette Eppendorf (Sarstedt, Nümbrecht, Germania) contenenti 200 μL di tampone TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6). I campioni sono stati conservati a -80°C fino all'estrazione del DNA.

Identificazione dei lattobacilli mediante coltura e PCR Aliquote di saliva sono state piastrate su agar Rogosa (Merck, Darmstadt, Germania) per ottenere la conta dei Lactobacillus e su agar selettivo per l'identificazione provvisoria dei ceppi di L. reuteri (DSM 17938 e PTA 5289) [33]. Tutte le piastre sono state incubate anaerobicamente a 37°C per 48-72 ore, eccetto L. reuteri PTA 5289, che è stato incubato anaerobicamente a 40°C per 72 ore.

Il DNA è stato estratto dai pellet di saliva come descritto [34]. La PCR specifica per L. reuteri DSM 17938 e PTA 5289 è stata identificata utilizzando KAPA2G Robust HotStart PCR Ready Mix (2 ×) (Kapa Biosystems, Boston, MA, USA) e primer specifici per ceppo [31]. In breve, 2 µL di estratto di DNA sono stati aggiunti a un volume di reazione totale di 25 µL (contenente 12,5 µL di master mix e ciascuna coppia di primer a una concentrazione di 0,5 µM). Le condizioni della PCR erano 95°C per 3 min; 40 cicli di 95°C per 15 s, 60°C per 15 s e 72°C per 30 s; e 72°C per 5 min. I prodotti PCR sono stati quindi verificati mediante elettroforesi su gel di agarosio al 2% lasciati correre per 80 minuti a 120 V in tampone 0,5 × TBE (Tris/borato/EDTA), pH 8,3, seguito da colorazione con bromuro di etidio (0,2 µg/µL).

Analisi di pirosequenziamento Per l'analisi di pirosequenziamento 454, 16 soggetti sono stati selezionati in modo casuale tra i soggetti di prova (n = 8) e di controllo (n = 8) (Figura S1). Il DNA è stato estratto dal basale, dall'esposizione di 12 settimane e dai campioni di biofilm dentale di follow-up di 1 mese come descritto in precedenza [34]. La regione ipervariabile V3-V4 del gene 16S rRNA è stata amplificata tramite PCR utilizzando il forward primer 347F e il reverse primer 803R [35]. Per l'identificazione del campione, i primer di fusione sono stati creati da questi primer e sequenze di codici a barre univoche secondo le linee guida Roche per la progettazione di ampliconi sperimentali (www.454.com). Il DNA è stato amplificato nelle seguenti condizioni di funzionamento: denaturazione iniziale a 94°C per 3 min; 30 cicli di 94ºC per 15 s, 58ºC per 15 s e 72ºC per 30 s; e un'estensione finale a 72ºC per 8 min.

L'elaborazione dell'amplicone e il sequenziamento 454 sono stati condotti presso la Lund University Sequencing Facility (Facoltà di Scienze, Lund, Svezia). Dopo la pulizia dell'amplicone per rimuovere brevi frammenti (Agencourt AMPure XP; Beckman Coulter, Brea, CA, USA) e l'ispezione (Kit DNA 1000 su un bioanalizzatore 2100; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), gli ampliconi sono stati quantificati (Quant-iT ds DNA assay kit; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA e Quantifluor fluorometer; Promega, Madison, WI, USA) e diluito per ottenere un totale di 107 copie/μL. La titolazione e la produzione di librerie (obiettivo: arricchimento del 10% -15%) sono state eseguite utilizzando la PCR in emulsione e il kit Lib-A (Roche Diagnostics, Branford, CT, USA). Le sfere positive al DNA sono state arricchite, contate (contatore di particelle Innovatis CASY; Roche Innovatis, Bielefeld, Germania), elaborate (kit di sequenziamento XLR70; Roche Diagnostics) e caricate su una piastra di picotiter per il pirosequenziamento su una macchina 454 Life Sciences Genome Sequencer FLX+ ( Roche Applied Sciences, Penzberg, Germania).

Elaborazione dei dati I dati relativi alle caratteristiche, alla conformità e alla cultura del soggetto sono stati elaborati utilizzando SPSS (versione 22.0; IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Sono state calcolate statistiche descrittive, come medie [intervalli di confidenza al 95% (CI)] e distribuzioni proporzionali. Le differenze tra i gruppi sono state testate con test parametrici o non parametrici a seconda della misurazione dei dati e dei livelli di distribuzione. P <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Sequenze con una lunghezza minima di 300 coppie di basi dopo la rimozione della sequenza di primer, sequenze di codici a barre corrette, un massimo di 1 coppia di basi errata nelle sequenze di primer e conformità con i criteri di qualità predefiniti per gli omopolimeri e i punteggi di qualità in Quantitative Insights into Microbial Ecology ( QIIME) [36] pacchetto software (versione 1.8.0) sono stati conservati per l'analisi. Qualsiasi sequenza oltre il primer invertito è stata rimossa. Le sequenze che iniziano con il primer inverso sono state complementate al contrario. Le sequenze sono state quindi raggruppate in unità tassonomiche operative (OTU) con una somiglianza di sequenza del 97% nel database Greengene 16S rRNA controllato da chimera (datato maggio 2013) [37] utilizzando USEARCH [38]. Le OTU con una singola sequenza sono state rimosse. Una sequenza rappresentativa per OTU rimanente è stata assegnata tassonomicamente come specie coltivabile con nome o senza nome o filotipo non coltivabile con identità ≥98,5% utilizzando HOMD 16S rRNA RefSeq, versione 12.0 (//www.homd.org) [28].

Le curve di rarefazione sono state calcolate per confrontare la ricchezza microbica [39]. L'analisi delle coordinate principali (PCoA) è stata applicata per valutare la diversità beta filogenetica [40] dei profili batterici in diversi punti temporali. È stata eseguita la modellazione multivariata dell'analisi parziale dei minimi quadrati (PLS) (SIMCA P+, versione 12.0; Umetrics AB, Umeå, Svezia) per cercare se le strutture del microbiota fossero correlate al consumo di L. reuteri (variabili y) [41,42]. I modelli testati includevano solo dati di pirosequenziamento e quelli a cui erano stati aggiunti dati di coltura e PCR di lattobacilli e streptococchi. Le variabili sono state ridimensionate automaticamente alla varianza unitaria e sono state calcolate le previsioni Y con convalida incrociata. Il raggruppamento dei soggetti è stato visualizzato nei grafici di caricamento del punteggio e l'importanza di ciascuna variabile x è stata visualizzata nei grafici di caricamento. Le variabili in cui l'intervallo di confidenza al 95% del coefficiente di correlazione PLS non includeva zero sono state considerate statisticamente significative [42]. Il valore Q2 ha prodotto le capacità delle variabili x di prevedere il risultato (test o assegnazione del gruppo placebo). Le analisi univariate dei singoli taxa non sono state applicate a causa della combinazione di piccoli gruppi e di un numero elevato di test ripetuti.