Пробиотик Lactobacillus Reuteri и микробиота полости рта (OMICI)

Заявления об этике Исследование было одобрено Региональным советом по этике в Умео, Швеция (Dnr 2011-380-31M), и проводилось в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации. От всех участников было получено письменное информированное согласие.

Субъекты и дизайн исследования Здоровые взрослые добровольцы в возрасте от 20 до 66 лет из числа студентов и сотрудников медицинского факультета Университета Умео, Швеция, были привлечены к участию в двойном слепом рандомизированном контролируемом исследовании (РКИ) посредством рекламы. Критериями включения были самооценка здоровья и отсутствие приема антибиотиков или пробиотических продуктов в течение 3 месяцев до исследования. Основываясь на предыдущих исследованиях устойчивости пробиотических штаммов [31,32], целью набора было не менее 15 человек на исследовательскую группу.

Сорок четыре добровольца, ни один из которых не употреблял табачные изделия, были набраны и случайным образом распределены либо в группу тестирования (n = 22), либо в группу плацебо (n = 22; рисунок S1). Участников попросили позволить 2 леденцам в день медленно таять во рту и циркулировать растворенным содержимым таблетки вокруг рта. Принимали по одной таблетке утром и вечером в течение 12 недель. Тестовые пастилки содержали L. reuteri (DSM 17938 и PTA 5289; 108 КОЕ на штамм; BioGaia AB, Стокгольм, Швеция), изомальт, гидрогенизированное пальмовое масло, ароматизаторы мяты перечной и ментола, масло перечной мяты и сукралозу (http://www. biogaia.com/product/biogaia-prodentis-oral-lozenges). Таблетки для рассасывания плацебо были идентичны испытуемым по внешнему виду, вкусу и составу, за исключением лактобацилл. Соответствие контролировали как процент потребленных леденцов от общего назначенного количества. Оставшиеся пастилки подсчитывали, когда контейнеры возвращали для ежемесячного заполнения, чтобы оценить этот фактор. Приверженность считалась приемлемой, если оставалось ≤15% пастилок. Участников попросили воздержаться от гигиены полости рта в течение 48 часов и не употреблять никакой пищи в течение как минимум 4 часов перед взятием проб. Участникам также было рекомендовано не употреблять пробиотические продукты в течение всего периода исследования.

Образцы слюны и биопленки Образцы слюны и биопленки зубов были получены непосредственно перед (исходный уровень) и через 4, 8 и 12 недель приема L. reuteri (рис. S1). Последующие образцы были собраны через 1 и 6 месяцев после прекращения приема добавок. Кроме того, вся стимулированная слюна (~ 5 мл) была получена путем жевания 1 г парафина и собрана в охлажденные льдом стерильные пробирки. Один миллилитр слюны использовали для культурального анализа, а оставшуюся слюну центрифугировали при 3500×g в течение 10 мин при 4°С. Осадки хранили при -80°C до выделения ДНК для проведения штамм-специфических ПЦР-реакций. Для пиросеквенирования объединенный наддесневой зубной налет собирали стерилизованными зубочистками и переносили в пробирки Эппендорфа (Sarstedt, Nümbrecht, Germany), содержащие 200 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 7,6). Образцы хранили при -80°С до выделения ДНК.

Идентификация лактобактерий с помощью посева и ПЦР Аликвоты слюны высевали на агар Рогоза (Merck, Дармштадт, Германия) для подсчета количества лактобацилл и на селективный агар для предварительной идентификации штаммов L. reuteri (DSM 17938 и PTA 5289) [33]. Все планшеты инкубировали в анаэробных условиях при 37°C в течение 48-72 часов, за исключением L. reuteri PTA 5289, который инкубировали в анаэробных условиях при 40°C в течение 72 часов.

ДНК выделяли из гранул слюны, как описано [34]. L. reuteri DSM 17938 и PTA 5289-специфический ПЦР идентифицировали с использованием KAPA2G Robust HotStart PCR Ready Mix (2×) (Kapa Biosystems, Бостон, Массачусетс, США) и штаммоспецифических праймеров [31]. Вкратце, 2 мкл экстракта ДНК добавляли к общему реакционному объему 25 мкл (содержащему 12,5 мкл мастер-микса и каждую пару праймеров в концентрации 0,5 мкМ). Условия ПЦР: 95°С в течение 3 мин; 40 циклов: 95°С в течение 15 с, 60°С в течение 15 с и 72°С в течение 30 с; и 72°С в течение 5 мин. Затем продукты ПЦР проверяли с помощью электрофореза на 2% агарозных гелях, которым давали поработать в течение 80 минут при 120 В в 0,5× ТВЕ (трис/борат/ЭДТА) буфере, рН 8,3, с последующим окрашиванием бромистым этидием (0,2 мкг/мкл).

Анализ пиросеквенирования Для анализа пиросеквенирования 454 человек было случайным образом выбрано 16 субъектов из числа испытуемых (n = 8) и контрольных (n = 8) субъектов (рис. S1). ДНК экстрагировали из образцов биопленки исходного уровня, 12-недельной экспозиции и 1-месячного последующего наблюдения, как описано ранее [34]. Гипервариабельный участок V3-V4 гена 16S рРНК амплифицировали методом ПЦР с использованием прямого праймера 347F и обратного праймера 803R [35]. Для идентификации образцов из этих праймеров и уникальных последовательностей штрих-кодов были созданы гибридные праймеры в соответствии с рекомендациями Roche по дизайну экспериментальных ампликонов (www.454.com). ДНК амплифицировали при следующих рабочих условиях: начальная денатурация при 94°С в течение 3 мин; 30 циклов 94°С в течение 15 с, 58°С в течение 15 с и 72°С в течение 30 с; и окончательное удлинение при 72ºC в течение 8 мин.

Обработку ампликонов и секвенирование 454 проводили в Центре секвенирования Лундского университета (факультет естественных наук, Лунд, Швеция). После очистки ампликонов для удаления коротких фрагментов (Agencourt AMPure XP; Beckman Coulter, Бреа, Калифорния, США) и проверки (набор ДНК 1000 на биоанализаторе 2100; Agilent Technologies, Пало-Альто, Калифорния, США) ампликоны определяли количественно (Quant-iT). набор для анализа ДНК ds; Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США, и флуорометр Quantifluor; Promega, Мэдисон, Висконсин, США) и разбавляли до получения в общей сложности 107 копий/мкл. Титрование и создание библиотеки (цель: обогащение 10-15%) выполняли с помощью эмульсионной ПЦР и набора Lib-A (Roche Diagnostics, Бранфорд, Коннектикут, США). ДНК-положительные шарики обогащали, подсчитывали (счетчик частиц Innovatis CASY; Roche Innovatis, Билефельд, Германия), обрабатывали (набор для секвенирования XLR70; Roche Diagnostics) и загружали на планшет для пикотирования для пиросеквенирования на машине 454 Life Sciences Genome Sequencer FLX+ ( Roche Applied Sciences, Пенцберг, Германия).

Обработка данных Данные о характеристиках субъекта, соответствии и культуре обрабатывали с использованием SPSS (версия 22.0; IBM Corporation, Армонк, штат Нью-Йорк, США). Были рассчитаны описательные статистические данные, такие как средние [95% доверительные интервалы (ДИ)] и пропорциональные распределения. Различия между группами проверялись параметрическими или непараметрическими тестами в зависимости от измерения данных и уровней распределения. P <0,05 считался статистически значимым.

Последовательности с минимальной длиной 300 пар оснований после удаления последовательности праймеров, правильные последовательности штрих-кодов, максимум 1 неправильная пара оснований в последовательностях праймеров и соответствие критериям качества по умолчанию для гомополимеров и показателям качества в Quantitative Insights in Microbial Ecology ( Пакет программ QIIME) [36] (версия 1.8.0) был оставлен для анализа. Любую последовательность за пределами обратного праймера удаляли. Последовательности, начинающиеся с обратного праймера, подвергались обратной комплементации. Затем последовательности были сгруппированы в операционные таксономические единицы (OTU) при сходстве последовательностей 97% в базе данных Greengene, проверенной на химере 16S рРНК (датирована маем 2013 г.) [37] с использованием USEARCH [38]. OTU с одной последовательностью были удалены. Одна репрезентативная последовательность на оставшуюся OTU была таксономически отнесена к названному или неназванному культивируемому виду или некультивируемому филотипу с идентичностью ≥98,5% с использованием HOMD 16S rRNA RefSeq, версия 12.0 (http://www.homd.org) [28].

Кривые разрежения были рассчитаны для сравнения микробного богатства [39]. Анализ основных координат (PCoA) был применен для оценки филогенетического бета-разнообразия [40] бактериальных профилей в разные моменты времени. Моделирование многомерного частичного анализа наименьших квадратов (PLS) (SIMCA P+, версия 12.0; Umetrics AB, Умео, Швеция) было выполнено для поиска того, связаны ли структуры микробиоты с потреблением L. reuteri (y-переменные) [41,42]. Тестируемые модели включали модели только с данными пиросеквенирования и те, к которым были добавлены культура лактобацилл и стрептококков и данные ПЦР. Переменные были автоматически масштабированы до единицы дисперсии, и были рассчитаны перекрестно подтвержденные прогнозы Y. Кластеризация субъектов отображалась на графиках загрузки баллов, а важность каждой x-переменной отображалась на графиках загрузки. Переменные, в которых 95% ДИ коэффициента корреляции PLS не включал ноль, считались статистически значимыми [42]. Значение Q2 давало возможность x-переменных прогнозировать результат (распределение группы теста или плацебо). Однофакторный анализ отдельных таксонов не применялся из-за сочетания небольших групп и большого количества повторных тестов.