Probiótico Lactobacillus Reuteri e Microbiota Oral (OMICI)

Declarações éticas O estudo foi aprovado pelo Conselho Regional de Revisão Ética em Umeå, Suécia (Dnr 2011-380-31M) e foi conduzido de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes.

Sujeitos e desenho do estudo Voluntários adultos saudáveis, com idades entre 20 e 66 anos, entre estudantes e funcionários da Faculdade de Medicina da Universidade de Umeå, na Suécia, foram recrutados para um estudo randomizado controlado (ECR) duplo-cego por meio de anúncios. Os critérios de inclusão foram um estado de saúde autorreferido e nenhum uso de antibióticos ou produtos probióticos durante os 3 meses anteriores ao estudo. Com base em estudos anteriores sobre a persistência de cepas probióticas [31,32], a meta de recrutamento era de pelo menos 15 pessoas por grupo de estudo.

Quarenta e quatro voluntários, nenhum dos quais usava produtos de tabaco, foram recrutados e alocados aleatoriamente para um teste (n = 22) ou grupo placebo (n = 22; Figura S1). Os participantes foram convidados a permitir que 2 pastilhas por dia derretessem lentamente na boca e a circular o conteúdo do comprimido dissolvido em torno de suas bocas. Uma pastilha foi tomada pela manhã e outra à noite por 12 semanas. As pastilhas de teste continham L. reuteri (DSM 17938 e PTA 5289; 108 CFU por cepa; BioGaia AB, Estocolmo, Suécia), isomalte, óleo de palma hidrogenado, aroma de hortelã-pimenta e mentol, óleo de hortelã-pimenta e sucralose (http://www. biogaia.com/product/biogaia-prodentis-oral-lozenges). As pastilhas de placebo eram idênticas às pastilhas de teste em aparência, sabor e composição, exceto os lactobacilos. A conformidade foi monitorada como a porcentagem de pastilhas consumidas do número total atribuído. As pastilhas restantes foram contadas quando as embalagens foram devolvidas para recargas mensais para avaliar esse fator. A adesão foi considerada aceitável se ≤15% das pastilhas permaneceram. Os participantes foram orientados a se abster de higiene bucal por 48 horas e não consumir qualquer alimento por pelo menos 4 horas antes da amostragem. Os participantes também foram instruídos a não comer produtos probióticos durante o período do estudo.

Amostragem de saliva e biofilme Amostras de saliva e biofilme dentário foram obtidas imediatamente antes (basal) e após 4, 8 e 12 semanas de suplementação com L. reuteri (Figura S1). Amostras de acompanhamento foram coletadas 1 e 6 meses após o término da suplementação. Além disso, toda a saliva estimulada (~ 5 mL) foi gerada pela mastigação de 1 g de parafina e coletada em tubos de ensaio estéreis resfriados com gelo. Um mililitro de saliva foi usado para análise cultural, e a saliva restante foi centrifugada a 3.500 × g por 10 minutos a 4°C. Os pellets foram armazenados a -80°C até a extração do DNA para reações de PCR específicas da cepa. Para a análise de pirosequenciamento, a placa supragengival reunida foi coletada com palitos esterilizados e transferida para tubos Eppendorf (Sarstedt, Nümbrecht, Alemanha) contendo 200 µL de tampão TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6). As amostras foram armazenadas a -80°C até a extração do DNA.

Identificação de lactobacilos por cultura e PCR Alíquotas de saliva foram semeadas em ágar Rogosa (Merck, Darmstadt, Alemanha) para obter contagens de Lactobacillus e em ágar seletivo para identificação tentativa das cepas de L. reuteri (DSM 17938 e PTA 5289) [33]. Todas as placas foram incubadas anaerobicamente a 37°C por 48-72 h, exceto L. reuteri PTA 5289, que foi incubada anaerobicamente a 40°C por 72 h.

O DNA foi extraído de pelotas de saliva como descrito [34]. L. reuteri DSM 17938 e PCR específico para PTA 5289 foram identificados usando KAPA2G Robust HotStart PCR Ready Mix (2 ×) (Kapa Biosystems, Boston, MA, EUA) e primers específicos para cepas [31]. Resumidamente, 2 µL de extrato de DNA foram adicionados a um volume total de reação de 25 µL (contendo 12,5 µL de master mix e cada par de primers em uma concentração de 0,5 µM). As condições de PCR foram 95°C por 3 min; 40 ciclos de 95°C por 15 segundos, 60°C por 15 segundos e 72°C por 30 segundos; e 72°C por 5 min. Os produtos de PCR foram então verificados por eletroforese em géis de agarose a 2% deixados correr por 80 min a 120 V em tampão 0,5 × TBE (Tris/Borato/EDTA), pH 8,3, seguido de coloração com brometo de etídio (0,2 µg/µL).

Análise de pirosequenciamento Para a análise de 454 pirosequenciamentos, 16 indivíduos foram selecionados aleatoriamente entre os sujeitos de teste (n = 8) e controle (n = 8) (Figura S1). O DNA foi extraído da linha de base, exposição de 12 semanas e amostras de biofilme dentário de acompanhamento de 1 mês, conforme descrito anteriormente [34]. A região hipervariável V3-V4 do gene 16S rRNA foi amplificada via PCR usando o primer direto 347F e o primer reverso 803R [35]. Para identificação da amostra, os primers de fusão foram criados a partir desses primers e sequências de código de barras exclusivas de acordo com as diretrizes da Roche para design de amplicon experimental (www.454.com). O DNA foi amplificado nas seguintes condições de execução: desnaturação inicial a 94°C por 3 min; 30 ciclos de 94ºC por 15 s, 58ºC por 15 s e 72ºC por 30 s; e uma extensão final a 72ºC por 8 min.

O processamento do amplicon e o sequenciamento 454 foram conduzidos na Lund University Sequencing Facility (Faculdade de Ciências, Lund, Suécia). Após a limpeza do amplicon para remover fragmentos curtos (Agencourt AMPure XP; Beckman Coulter, Brea, CA, EUA) e inspeção (kit DNA 1000 em um 2100 Bioanalyzer; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA), os amplicons foram quantificados (Quant-iT ds DNA assay kit; Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA e fluorômetro Quantifluor; Promega, Madison, WI, EUA) e diluído para obter um total de 107 cópias/μL. A titulação e a produção da biblioteca (alvo: 10%-15% de enriquecimento) foram realizadas usando PCR em emulsão e o kit Lib-A (Roche Diagnostics, Branford, CT, EUA). As esferas de DNA positivo foram enriquecidas, contadas (contador de partículas Innovatis CASY; Roche Innovatis, Bielefeld, Alemanha), processadas (kit de sequenciamento XLR70; Roche Diagnostics) e carregadas em uma placa de picotitulação para pirosequenciamento em uma máquina 454 Life Sciences Genome Sequencer FLX+ ( Roche Applied Sciences; Penzberg, Alemanha).

Processamento de dados Os dados de característica, conformidade e cultura do sujeito foram processados ​​usando SPSS (versão 22.0; IBM Corporation, Armonk, NY, EUA). Estatísticas descritivas, como médias [intervalos de confiança (IC) de 95%] e distribuições de proporções foram calculadas. As diferenças entre os grupos foram testadas com testes paramétricos ou não paramétricos, dependendo dos níveis de medição e distribuição dos dados. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Sequências com um comprimento mínimo de 300 pares de bases após a remoção da sequência do primer, sequências de código de barras corretas, no máximo 1 par de bases incorreto nas sequências do primer e conformidade com os critérios de qualidade padrão para homopolímeros e pontuações de qualidade no Quantitative Insights into Microbial Ecology ( QIIME) [36] pacote de software (versão 1.8.0) foram retidos para análise. Qualquer sequência além do primer reverso foi removida. As sequências que começam com o primer reverso foram complementadas reversamente. As sequências foram então agrupadas em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) em uma similaridade de sequência de 97% no banco de dados Greengene verificado por quimera 16S rRNA (datado de maio de 2013) [37] usando USEARCH [38]. OTUs com uma única sequência foram removidos. Uma sequência representativa por OTU restante foi atribuída taxonomicamente como espécie cultivável nomeada ou não nomeada ou filotipo não cultivável com identidade ≥98,5% usando HOMD 16S rRNA RefSeq, versão 12.0 (http://www.homd.org) [28].

Curvas de rarefação foram calculadas para comparar a riqueza microbiana [39]. A análise coordenada principal (PCoA) foi aplicada para avaliar a diversidade beta filogenética [40] dos perfis bacterianos em diferentes momentos. A modelagem multivariada de análise parcial de mínimos quadrados (PLS) (SIMCA P+, versão 12.0; Umetrics AB, Umeå, Suécia) foi realizada para pesquisar se as estruturas da microbiota estavam relacionadas ao consumo de L. reuteri (variáveis ​​y) [41,42]. Os modelos testados incluíram aqueles com apenas dados de pirosequenciamento e aqueles aos quais foram adicionados cultura de lactobacilos e estreptococos e dados de PCR. As variáveis ​​foram dimensionadas automaticamente para a variância da unidade e as previsões Y validadas cruzadas foram calculadas. O agrupamento de assuntos foi exibido em gráficos de carregamento de pontuação e a importância de cada variável x foi exibida em gráficos de carregamento. As variáveis ​​em que o IC 95% do coeficiente de correlação PLS não incluiu zero foram consideradas estatisticamente significativas [42]. O valor Q2 forneceu as capacidades das variáveis ​​x para prever o resultado (teste ou alocação do grupo placebo). Análises univariadas de taxa única não foram aplicadas devido à combinação de pequenos grupos e um alto número de testes repetidos.