Probiootti Lactobacillus Reuteri ja suun mikrobiota (OMICI)

Eettiset lausunnot Tutkimuksen hyväksyi Uumajan alueellinen eettinen arviointilautakunta (Dnr 2011-380-31M) ja se suoritettiin Helsingin julistuksessa esitettyjen periaatteiden mukaisesti. Kaikilta osallistujilta saatiin kirjallinen tietoinen suostumus.

Kohteet ja tutkimuksen suunnittelu Terveitä aikuisia vapaaehtoisia, iältään 20–66-vuotiaita, Uumajan yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan opiskelijoista ja työntekijöistä rekrytoitiin mainosten avulla kaksoissokkoutettuun, satunnaistettuun kontrolloituun tutkimukseen (RCT). Sisällyttämiskriteerit olivat itse ilmoittama terve tila ja antibioottien tai probioottisten tuotteiden käyttämättä jättäminen 3 kuukauden aikana ennen tutkimusta. Aiempien probioottisten kantojen pysyvyyttä koskevien tutkimusten [31,32] perusteella rekrytointitavoite oli vähintään 15 henkilöä tutkimusryhmää kohden.

Neljäkymmentäneljä vapaaehtoista, joista yksikään ei käyttänyt tupakkatuotteita, rekrytoitiin ja jaettiin satunnaisesti joko testiryhmään (n = 22) tai lumeryhmään (n = 22; kuva S1). Osallistujia pyydettiin antamaan 2 pastillia päivässä sulaa hitaasti suussa ja kiertämään liuennut tabletin sisältö suunsa ympärillä. Yksi imeskelytabletti otettiin aamulla ja yksi illalla 12 viikon ajan. Testitabletit sisälsivät L. reuteria (DSM 17938 ja PTA 5289; 108 CFU kantaa kohden; BioGaia AB, Tukholma, Ruotsi), isomaltia, hydrattua palmuöljyä, piparminttu- ja mentoliaromia, piparminttuöljyä ja sukraloosia (http://www. biogaia.com/product/biogaia-prodentis-oral-imeskelytabletit). Plasebo-imeskelytabletit olivat identtisiä koetablettien kanssa ulkonäöltään, maultaan ja koostumukseltaan laktobasilleja lukuun ottamatta. Vaatimustenmukaisuutta seurattiin käytettyjen imeskelytablettien prosenttiosuutena määrätystä kokonaismäärästä. Jäljellä olevat imeskelytabletit laskettiin, kun säiliöt palautettiin kuukausittain täyttöä varten tämän tekijän arvioimiseksi. Vaatimustenmukaisuus katsottiin hyväksyttäväksi, jos ≤15 % imeskelytableteista oli jäljellä. Osallistujia pyydettiin pidättymään suuhygieniasta 48 tunnin ajan ja olemaan syömättä mitään ruokaa vähintään 4 tuntiin ennen näytteenottoa. Osallistujia kehotettiin myös olemaan syömättä probioottisia tuotteita koko tutkimusjakson ajan.

Syljen ja biofilmin näytteenotto Sylki- ja hampaiden biofilminäytteet otettiin välittömästi ennen (perustaso) ja 4, 8 ja 12 viikon L. reuteri -lisäyksen jälkeen (kuva S1). Seurantanäytteet kerättiin 1 ja 6 kuukauden kuluttua täydennyksen lopettamisesta. Lisäksi koko stimuloitua sylkeä (~ 5 ml) tuotettiin pureskelemalla 1 g parafiinia ja kerättiin jääjäähdytettyihin steriileihin koeputkiin. Yksi millilitra sylkeä käytettiin viljelyanalyysiin, ja jäljellä olevaa sylkeä sentrifugoitiin 3 500 x g:ssä 10 minuuttia 4 °C:ssa. Pellettejä säilytettiin -80 °C:ssa DNA-uuttoon asti kantaspesifisiä PCR-reaktioita varten. Pyrosekvensointianalyysiä varten yhdistetty supragingivaalinen plakki kerättiin steriloiduilla hammastikuilla ja siirrettiin Eppendorf-putkiin (Sarstedt, Nümbrecht, Saksa), jotka sisälsivät 200 ui TE-puskuria (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6). Näytteitä säilytettiin -80 °C:ssa DNA-uuttoon asti.

Laktobasillien tunnistus viljelmällä ja PCR:llä Sylkieriä maljattiin Rogosa-agarille (Merck, Darmstadt, Saksa) Lactobacillus-määrien saamiseksi ja selektiiviselle agarille L. reuteri (DSM 17938 ja PTA 5289) [333] -kantojen alustavaa tunnistamista varten. Kaikkia levyjä inkuboitiin anaerobisesti 37 °C:ssa 48-72 tuntia, paitsi L. reuteri PTA 5289, jota inkuboitiin anaerobisesti 40 °C:ssa 72 tuntia.

DNA uutettiin sylkipelleteistä kuvatulla tavalla [34]. L. reuteri DSM 17938 ja PTA 5289 -spesifinen PCR tunnistettiin käyttämällä KAPA2G Robust HotStart PCR Ready Mixiä (2×) (Kapa Biosystems, Boston, MA, USA) ja kantaspesifisiä alukkeita [31]. Lyhyesti, 2 ui DNA-uutetta lisättiin 25 ui:n kokonaisreaktiotilavuuteen (sisältäen 12,5 ui perusseosta ja kutakin alukeparia pitoisuutena 0,5 uM). PCR-olosuhteet olivat 95 °C 3 minuutin ajan; 40 sykliä 95°C 15 s, 60°C 15 s ja 72°C 30 s; ja 72 °C 5 minuutin ajan. PCR-tuotteet varmennettiin sitten elektroforeesilla 2-prosenttisilla agaroosigeeleillä, joiden annettiin käydä 80 minuuttia 120 V:ssa 0,5 x TBE (Tris/Borate/EDTA) -puskurissa, pH 8,3, mitä seurasi etidiumbromidivärjäys (0,2 ug/ul).

Pyrosekvensointianalyysi 454 pyrosekvensointianalyysiä varten 16 koehenkilöä valittiin satunnaisesti koehenkilöiden (n = 8) ja kontrollin (n = 8) joukosta (kuva S1). DNA uutettiin lähtötilanteen, 12 viikon altistuksen ja 1 kuukauden seurantahampaiden biofilminäytteistä, kuten aiemmin on kuvattu [34]. 16S-rRNA-geenin V3-V4-hypervariaabeli alue monistettiin PCR:llä käyttämällä eteenpäin suunnattua aluketta 347F ja käänteistä aluketta 803R [35]. Näytteiden tunnistamista varten näistä alukkeista ja ainutlaatuisista viivakoodisekvensseistä luotiin fuusioalukkeet Rochen kokeellista amplikonisuunnittelua koskevien ohjeiden mukaisesti (www.454.com). DNA monistettiin seuraavissa ajo-olosuhteissa: alkuperäinen denaturaatio 94 °C:ssa 3 minuutin ajan; 30 sykliä 94 ºC 15 s, 58 ºC 15 s ja 72 ºC 30 s; ja lopullinen pidennys 72 ºC:ssa 8 minuutin ajan.

Amplikonikäsittely ja 454-sekvensointi suoritettiin Lundin yliopiston sekvensointilaitoksessa (luonnontieteellinen tiedekunta, Lund, Ruotsi). Amplikonien puhdistuksen lyhyiden fragmenttien poistamiseksi (Agencourt AMPure XP; Beckman Coulter, Brea, CA, USA) ja tarkastuksen (DNA 1000 -sarja 2100 Bioanalyzer -laitteella; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) jälkeen amplikonit kvantifioitiin (Quant-iT). ds DNA-määrityspakkaus; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ja Quantifluor-fluorometri; Promega, Madison, WI, USA) ja laimennettiin siten, että saadaan yhteensä 107 kopiota/μl. Titraus ja kirjaston tuotanto (tavoite: 10-15 % rikastus) suoritettiin käyttämällä emulsio-PCR:ää ja Lib-A-kittiä (Roche Diagnostics, Branford, CT, USA). DNA-positiiviset helmet rikastettiin, laskettiin (Innovatis CASY -hiukkaslaskuri; Roche Innovatis, Bielefeld, Saksa), käsiteltiin (XLR70-sekvensointipakkaus; Roche Diagnostics) ja ladattiin pikotiterilevylle pyrosekvensointia varten 454 Life Sciences Genome Sequencer FLX+ -koneella. Roche Applied Sciences; Penzberg, Saksa).

Tietojen käsittely Kohteen ominaispiirteiden, vaatimustenmukaisuuden ja viljelyn tiedot käsiteltiin käyttämällä SPSS:ää (versio 22.0; IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Laskettiin kuvaavat tilastot, kuten keskiarvot [95 % luottamusvälit (CI)] ja suhteelliset jakaumat. Ryhmien välisiä eroja testattiin parametrisilla tai ei-parametrisilla testeillä datan mittaus- ja jakautumistasoista riippuen. P < 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitseväksi.

Sekvenssejä, joiden pituus on vähintään 300 emäsparia alukesekvenssin poistamisen jälkeen, oikeat viivakoodisekvenssit, enintään 1 väärä emäspari alukesekvensseissä ja homopolymeerien oletuslaatukriteerien ja laatupisteiden noudattaminen julkaisussa Quantitative Insights into Microbial Ecology ( QIIME) [36] ohjelmistopaketti (versio 1.8.0) säilytettiin analysointia varten. Kaikki käänteisen alukkeen ulkopuoliset sekvenssit poistettiin. Käänteisalukkeella alkavat sekvenssit täydennettiin käänteisesti. Sekvenssit ryhmiteltiin sitten operatiivisiin taksonomisiin yksiköihin (OTU) 97 %:n sekvenssien samankaltaisuuteen 16S-rRNA-kimeeralla tarkastetussa Greengene-tietokannassa (päivätty toukokuussa 2013) [37] käyttämällä USEARCHia [38]. Yhden sekvenssin OTU:t poistettiin. Yksi edustava sekvenssi per jäljellä oleva OTU määritettiin taksonomisesti nimetyksi tai nimettömäksi viljelykelpoiseksi lajiksi tai viljelemättömäksi fylotyypiksi ≥98,5 %:n identtisyydellä käyttämällä HOMD 16S rRNA RefSeq, versiota 12.0 (http://www.homd.org) [28].

Harvinaisuuksien käyrät laskettiin vertaamaan mikrobirikkautta [39]. Pääkoordinaattianalyysiä (PCoA) käytettiin arvioimaan bakteeriprofiilien fylogeneettistä beeta-diversiteettiä [40] eri ajankohtina. Monimuuttuja osittainen pienimmän neliöanalyysin (PLS) mallinnus (SIMCA P+, versio 12.0; Umetrics AB, Umeå, Ruotsi) suoritettiin sen etsimiseksi, liittyivätkö mikrobiotrakenteet L. reuterin kulutukseen (y-muuttujat) [41,42]. Testattuihin malleihin sisältyivät vain pyrosekvensointitiedot sekä ne, joihin oli lisätty laktobasilli- ja streptokokkiviljely- ja PCR-tiedot. Muuttujat skaalattiin automaattisesti yksikkövarianssiksi ja ristiinvalidoidut Y-ennusteet laskettiin. Kohteiden klusterointi näytettiin pistemäärän latauskäyrissä, ja kunkin x-muuttujan tärkeys näytettiin latauskäyrissä. Muuttujia, joissa PLS-korrelaatiokertoimen 95 % luottamusväli ei sisältänyt nollaa, pidettiin tilastollisesti merkitsevinä [42]. Q2-arvo antoi x-muuttujien kyvyt ennustaa lopputulos (testi tai lumeryhmäjako). Yksittäisten taksonien yksimuuttujaanalyysejä ei sovellettu pienten ryhmien yhdistelmän ja toistuvien testien suuren määrän vuoksi.