Probiotyczny Lactobacillus Reuteri i mikroflora jamy ustnej (OMICI)

Oświadczenia etyczne Badanie zostało zatwierdzone przez Regionalną Komisję ds. Oceny Etycznej w Umeå w Szwecji (Dnr 2011-380-31M) i zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami wyrażonymi w Deklaracji Helsińskiej. Od wszystkich uczestników uzyskano pisemną świadomą zgodę.

Osoby badane i projekt badania Zdrowi dorośli ochotnicy w wieku 20-66 lat, będący studentami i pracownikami Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Umeå w Szwecji, zostali zwerbowani do podwójnie ślepej, randomizowanej, kontrolowanej próby (RCT) za pośrednictwem reklam. Kryteria włączenia obejmowały zgłaszany przez samych siebie stan zdrowia oraz brak stosowania antybiotyków lub produktów probiotycznych w ciągu 3 miesięcy przed badaniem. Na podstawie wcześniejszych badań dotyczących trwałości szczepów probiotycznych [31,32] celem rekrutacji było co najmniej 15 osób na grupę badawczą.

Czterdziestu czterech ochotników, z których żaden nie używał wyrobów tytoniowych, zostało zwerbowanych i losowo przydzielonych do grupy testowej (n = 22) lub placebo (n = 22; ryc. S1). Uczestników poproszono o pozwolenie, aby 2 pastylki do ssania dziennie powoli rozpuszczały się w jamie ustnej i rozprowadzały rozpuszczoną zawartość tabletki wokół ust. Jedna pastylka była przyjmowana rano i jedna wieczorem przez 12 tygodni. Testowe pastylki do ssania zawierały L. reuteri (DSM 17938 i PTA 5289; 108 CFU na szczep; BioGaia AB, Sztokholm, Szwecja), izomalt, uwodorniony olej palmowy, aromat miętowy i mentolowy, olejek miętowy i sukralozę (http://www. biogaia.com/product/biogaia-prodentis-oral-lozenges). Pastylki placebo były identyczne z pastylkami testowymi pod względem wyglądu, smaku i składu, z wyjątkiem pałeczek kwasu mlekowego. Zgodność monitorowano jako procent zużytych pastylek do całkowitej przydzielonej liczby. Pozostałe pastylki do ssania policzono, gdy pojemniki były zwracane do comiesięcznych uzupełnień w celu oceny tego czynnika. Zgodność uznano za akceptowalną, jeśli pozostało ≤15% pastylek do ssania. Uczestników poproszono o powstrzymanie się od higieny jamy ustnej przez 48 godzin i niespożywanie pokarmu przez co najmniej 4 godziny przed pobraniem próbki. Uczestników poinstruowano również, aby nie spożywali produktów probiotycznych przez cały okres badania.

Próbki śliny i biofilmu Próbki śliny i biofilmu zębów pobrano bezpośrednio przed (linia bazowa) i po 4, 8 i 12 tygodniach suplementacji L. reuteri (Rysunek S1). Próbki kontrolne pobierano 1 i 6 miesięcy po zakończeniu suplementacji. Ponadto wytworzono całą stymulowaną ślinę (~5 ml) przez żucie 1 g parafiny i zebrano do schłodzonych w lodzie sterylnych probówek testowych. Do analizy kultur użyto jednego mililitra śliny, a pozostałą ślinę odwirowano przy 3500 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Osady przechowywano w temperaturze -80°C do czasu ekstrakcji DNA do reakcji PCR specyficznych dla szczepu. Do analizy pirosekwencjonowania zebrano pulę płytki naddziąsłowej za pomocą wysterylizowanych wykałaczek i przeniesiono do probówek Eppendorfa (Sarstedt, Nümbrecht, Niemcy) zawierających 200 µl buforu TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6). Próbki przechowywano w temperaturze -80°C do czasu ekstrakcji DNA.

Identyfikacja pałeczek kwasu mlekowego przez hodowlę i PCR Podwielokrotności śliny wysiano na agar Rogosa (Merck, Darmstadt, Niemcy) w celu uzyskania liczby Lactobacillus oraz na agar selektywny w celu wstępnej identyfikacji szczepów L. reuteri (DSM 17938 i PTA 5289) [33]. Wszystkie płytki inkubowano w warunkach beztlenowych w temperaturze 37°C przez 48-72 godzin, z wyjątkiem L. reuteri PTA 5289, którą inkubowano w warunkach beztlenowych w temperaturze 40°C przez 72 godziny.

DNA ekstrahowano z grudek śliny, jak opisano [34]. Reakcje PCR specyficzne dla L. reuteri DSM 17938 i PTA 5289 zidentyfikowano przy użyciu KAPA2G Robust HotStart PCR Ready Mix (2×) (Kapa Biosystems, Boston, MA, USA) i starterów specyficznych dla szczepu [31]. W skrócie, 2 µl ekstraktu DNA dodano do całkowitej objętości reakcji 25 µl (zawierającej 12,5 µl mieszaniny głównej i każdą parę starterów w stężeniu 0,5 µM). Warunki PCR wynosiły 95°C przez 3 minuty; 40 cykli 95°C przez 15 s, 60°C przez 15 s i 72°C przez 30 s; i 72°C przez 5 min. Produkty PCR zostały następnie zweryfikowane przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym pozostawionym na 80 minut przy 120 V w buforze 0,5 x TBE (Tris/Boran/EDTA), pH 8,3, a następnie barwienie bromkiem etydyny (0,2 µg/µl).

Analiza pirosekwencjonowania Do 454 analizy pirosekwencjonowania wybrano losowo 16 osób spośród badanych (n = 8) i kontrolnych (n = 8) (rysunek S1). DNA ekstrahowano z próbek biofilmu zęba na linii podstawowej, 12-tygodniowej ekspozycji i 1-miesięcznej obserwacji kontrolnej, jak opisano wcześniej [34]. Region hiperzmienny V3-V4 genu 16S rRNA amplifikowano metodą PCR przy użyciu startera do przodu 347F i startera do tyłu 803R [35]. W celu identyfikacji próbek utworzono startery fuzyjne z tych starterów i unikalnych sekwencji kodów kreskowych zgodnie z wytycznymi firmy Roche dotyczącymi eksperymentalnego projektowania amplikonów (www.454.com). DNA amplifikowano w następujących warunkach: początkowa denaturacja w 94°C przez 3 minuty; 30 cykli 94ºC przez 15 s, 58ºC przez 15 s i 72ºC przez 30 s; i końcowe wydłużanie w 72°C przez 8 min.

Przetwarzanie amplikonu i sekwencjonowanie 454 przeprowadzono w Lund University Sequencing Facility (Wydział Naukowy, Lund, Szwecja). Po oczyszczeniu amplikonów w celu usunięcia krótkich fragmentów (Agencourt AMPure XP; Beckman Coulter, Brea, CA, USA) i kontroli (zestaw DNA 1000 na aparacie 2100 Bioanalyzer; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), amplikony oznaczono ilościowo (Quant-iT ds DNA assay kit; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA i fluorometr Quantifluor; Promega, Madison, WI, USA) i rozcieńczono do uzyskania łącznie 107 kopii/μl. Miareczkowanie i produkcję biblioteki (docelowo: 10%-15% wzbogacenia) przeprowadzono stosując PCR w emulsji i zestaw Lib-A (Roche Diagnostics, Branford, CT, USA). Kulki z dodatnim DNA zostały wzbogacone, zliczone (licznik cząstek Innovatis CASY; Roche Innovatis, Bielefeld, Niemcy), przetworzone (zestaw do sekwencjonowania XLR70; Roche Diagnostics) i załadowane na płytkę pikotitracyjną w celu pirosekwencjonowania na maszynie 454 Life Sciences Genome Sequencer FLX+ ( Roche Applied Sciences; Penzberg, Niemcy).

Przetwarzanie danych Charakterystyka podmiotu, zgodność i kultura zostały przetworzone przy użyciu SPSS (wersja 22.0; IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Obliczono statystyki opisowe, takie jak średnie [95% przedziały ufności (CI)] i rozkłady proporcji. Różnice między grupami badano testami parametrycznymi lub nieparametrycznymi w zależności od poziomu pomiaru i dystrybucji danych. P < 0,05 uznano za istotne statystycznie.

Sekwencje o minimalnej długości 300 par zasad po usunięciu sekwencji starterów, prawidłowe sekwencje kodu kreskowego, maksymalnie 1 nieprawidłowa para zasad w sekwencjach starterów oraz zgodność z domyślnymi kryteriami jakości dla homopolimerów i oceną jakości w Quantitative Insights into Microbial Ecology ( QIIME) [36] pakiet oprogramowania (wersja 1.8.0) zachowano do analizy. Wszelkie sekwencje poza odwróconym starterem usunięto. Sekwencje rozpoczynające się od startera wstecznego zostały odwrotnie uzupełnione. Sekwencje zostały następnie zgrupowane w operacyjne jednostki taksonomiczne (OTU) z podobieństwem sekwencji wynoszącym 97% w bazie danych Greengene sprawdzonej przez chimerę 16S rRNA (z maja 2013 r.) [37] przy użyciu USEARCH [38]. Usunięto OTU z pojedynczą sekwencją. Jedna reprezentatywna sekwencja na pozostałą OTU została taksonomicznie przypisana jako nazwany lub nienazwany gatunek nadający się do uprawy lub filotyp nienadający się do uprawy przy ≥ 98, 5% tożsamości przy użyciu HOMD 16S rRNA RefSeq, wersja 12.0 (//www.homd.org) [28].

Krzywe rozrzedzenia obliczono w celu porównania bogactwa drobnoustrojów [39]. Do oceny filogenetycznej różnorodności beta [40] profili bakteryjnych w różnych punktach czasowych zastosowano analizę głównych współrzędnych (PCoA). Modelowanie wielowymiarowej częściowej analizy najmniejszych kwadratów (PLS) (SIMCA P+, wersja 12.0; Umetrics AB, Umeå, Szwecja) przeprowadzono w celu sprawdzenia, czy struktury mikroflory są powiązane ze spożyciem L. reuteri (zmienne y) [41,42]. Testowane modele obejmowały te z danymi tylko z pirosekwencjonowania oraz te, do których dodano hodowlę pałeczek kwasu mlekowego i paciorkowców oraz dane PCR. Zmienne zostały automatycznie przeskalowane do wariancji jednostkowej i obliczono zweryfikowane krzyżowo prognozy Y. Grupowanie podmiotów zostało wyświetlone na wykresach ładowania wyników, a znaczenie każdej zmiennej x zostało wyświetlone na wykresach ładowania. Zmienne, dla których 95% CI współczynnika korelacji PLS nie zawierało zera, uznano za istotne statystycznie [42]. Wartość Q2 dała zdolność zmiennych x do przewidywania wyniku (przydział do grupy testowej lub placebo). Nie zastosowano jednowymiarowych analiz pojedynczych taksonów ze względu na połączenie małych grup i dużą liczbę powtarzanych testów.