Probiotisk Lactobacillus Reuteri og oral mikrobiota (OMICI)

Etikkerklæringer Studien ble godkjent av Regional Ethical Review Board i Umeå, Sverige (Dnr 2011-380-31M) og ble utført i henhold til prinsippene uttrykt i Helsinki-erklæringen. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne.

Fag og studiedesign Friske voksne frivillige, i alderen 20-66 år, blant studenter og ansatte ved det medisinske fakultetet, Umeå universitet, Sverige ble rekruttert til en dobbeltblind, randomisert kontrollert studie (RCT) gjennom annonser. Inklusjonskriterier var en selvrapportert sunn status og ingen bruk av antibiotika eller probiotiske produkter i løpet av 3 måneder før studien. Basert på tidligere studier angående persistens av probiotiske stammer [31,32], var rekrutteringsmålet minst 15 personer per studiegruppe.

44 frivillige, hvorav ingen brukte tobakksprodukter, ble rekruttert og tilfeldig fordelt til enten en test (n = 22) eller placebogruppe (n = 22; figur S1). Deltakerne ble bedt om å la 2 pastiller per dag sakte smelte i munnen og sirkulere det oppløste tablettinnholdet rundt munnen. En sugetablett ble tatt om morgenen og 1 om kvelden i 12 uker. Testpastillerne inneholdt L. reuteri (DSM 17938 og PTA 5289; 108 CFU per stamme; BioGaia AB, Stockholm, Sverige), isomalt, hydrogenert palmeolje, peppermynte og mentolsmak, peppermynteolje og sukralose (http://www. biogaia.com/product/biogaia-prodentis-oral-pastiller). Placebopastillerne var identiske med testpastillerne i utseende, smak og sammensetning bortsett fra laktobaciller. Overholdelse ble overvåket som prosentandelen av forbrukte pastiller av det totale tildelte antallet. De resterende pastiller ble talt når beholderne ble returnert for månedlig påfyll for å vurdere denne faktoren. Samsvar ble ansett som akseptabelt hvis ≤15 % av sugetablettene var igjen. Deltakerne ble bedt om å avstå fra munnhygiene i 48 timer og ikke innta mat i minst 4 timer før prøvetaking. Deltakerne ble også instruert om å ikke spise probiotiske produkter gjennom hele studieperioden.

Spytt- og biofilmprøvetaking Spytt- og tannbiofilmprøver ble tatt umiddelbart før (grunnlinje) og etter 4, 8 og 12 uker med L. reuteri-tilskudd (figur S1). Oppfølgingsprøver ble tatt 1 og 6 måneder etter at tilskuddet ble avsluttet. Videre ble helstimulert spytt (~5 ml) generert ved å tygge 1 g parafin og samlet inn i iskjølte sterile reagensrør. En milliliter spytt ble brukt til kulturanalyse, og det gjenværende spyttet ble sentrifugert ved 3500 × g i 10 minutter ved 4 °C. Pelletene ble lagret ved -80°C inntil DNA-ekstraksjon for stammespesifikke PCR-reaksjoner. For pyrosekvenseringsanalysen ble samlet supragingival plakk samlet opp med steriliserte tannpirkere og overført til Eppendorf-rør (Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland) inneholdende 200 µL TE-buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6). Prøvene ble lagret ved -80°C frem til DNA-ekstraksjon.

Identifikasjon av laktobaciller ved kultur og PCR Alikvoter av spytt ble sådd ut på Rogosa-agar (Merck, Darmstadt, Tyskland) for å oppnå Lactobacillus-tellinger og på selektiv agar for tentativ identifikasjon av L. reuteri (DSM 17938 og PTA 5289) stammer [33]. Alle platene ble anaerobt inkubert ved 37°C i 48-72 timer, bortsett fra L. reuteri PTA 5289, som ble inkubert anaerobt ved 40°C i 72 timer.

DNA ble ekstrahert fra spyttpellets som beskrevet [34]. L. reuteri DSM 17938 og PTA 5289-spesifikk PCR ble identifisert ved bruk av KAPA2G Robust HotStart PCR Ready Mix (2×) (Kapa Biosystems, Boston, MA, USA) og stammespesifikke primere [31]. Kort fortalt ble 2 µL DNA-ekstrakt tilsatt til et totalt reaksjonsvolum på 25 µL (inneholdt 12,5 µL masterblanding og hvert primerpar i en konsentrasjon på 0,5 µM). PCR-forholdene var 95°C i 3 minutter; 40 sykluser på 95°C i 15 s, 60°C i 15 s og 72°C i 30 s; og 72°C i 5 min. PCR-produkter ble deretter verifisert ved elektroforese på 2 % agarosegeler som fikk kjøre i 80 minutter ved 120 V i 0,5× TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer, pH 8,3, etterfulgt av etidiumbromid (0,2 µg/µL) farging.

Pyrosekvenseringsanalyse For 454 pyrosekvenseringsanalysen ble 16 forsøkspersoner tilfeldig valgt blant test- (n = 8) og kontroll- (n = 8) emner (figur S1). DNA ble ekstrahert fra baseline, 12-ukers eksponering og 1-måneders oppfølging av tannbiofilmprøver som tidligere beskrevet [34]. Den hypervariable V3-V4-regionen til 16S rRNA-genet ble amplifisert via PCR ved å bruke foroverprimeren 347F og reversprimeren 803R [35]. For prøveidentifikasjon ble fusjonsprimere laget av disse primerne og unike strekkodesekvenser i henhold til Roches retningslinjer for eksperimentell amplikondesign (www.454.com). DNA ble amplifisert under følgende driftsbetingelser: initial denaturering ved 94°C i 3 minutter; 30 sykluser på 94ºC i 15 s, 58ºC i 15 s og 72ºC i 30 s; og en siste utvidelse ved 72ºC i 8 min.

Amplicon-behandling og 454-sekvensering ble utført ved Lund University Sequencing Facility (Naturvitenskapelig fakultet, Lund, Sverige). Etter amplikonrensing for å fjerne korte fragmenter (Agencourt AMPure XP; Beckman Coulter, Brea, CA, USA) og inspeksjon (DNA 1000-sett på en 2100 Bioanalyzer; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), ble amplikonene kvantifisert (Quant-iT ds DNA-analysesett; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA og Quantifluor fluorometer; Promega, Madison, WI, USA) og fortynnet for å oppnå totalt 107 kopier/μL. Titrering og bibliotekproduksjon (mål: 10%-15% berikelse) ble utført ved bruk av emulsjons-PCR og Lib-A-settet (Roche Diagnostics, Branford, CT, USA). DNA-positive kuler ble anriket, talt (Innovatis CASY partikkelteller; Roche Innovatis, Bielefeld, Tyskland), behandlet (XLR70 sekvenseringssett; Roche Diagnostics), og lastet på en picotiterplate for pyrosekvensering på en 454 Life Sciences Genome Sequencer FLX+ maskin ( Roche Applied Sciences; Penzberg, Tyskland).

Databehandling Emnekarakteristikk, samsvar og kulturdata ble behandlet med SPSS (versjon 22.0; IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Beskrivende statistikk, som gjennomsnitt [95 % konfidensintervall (CI)] og andelsfordelinger ble beregnet. Forskjeller mellom grupper ble testet med parametriske eller ikke-parametriske tester avhengig av datamåling og distribusjonsnivåer. P < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.

Sekvenser med en minimumslengde på 300 basepar etter fjerning av primersekvens, korrekte strekkodesekvenser, maksimalt 1 feil basepar i primersekvensene, og samsvar med standard kvalitetskriterier for homopolymerer og kvalitetspoeng i Quantitative Insights into Microbial Ecology ( QIIME) [36] programvarepakke (versjon 1.8.0) ble beholdt for analyse. Enhver sekvens utover den reverserte primeren ble fjernet. Sekvenser som begynner med den reverserte primeren ble reverskomplementert. Sekvenser ble deretter gruppert i operasjonelle taksonomiske enheter (OTUs) med en sekvenslikhet på 97 % i den 16S rRNA-kimærsjekkede Greengene-databasen (datert mai 2013) [37] ved bruk av USEARCH [38]. OTUer med en enkelt sekvens ble fjernet. Én representativ sekvens per gjenværende OTU ble taksonomisk tilordnet som en navngitt eller ikke navngitt dyrkbar art eller ukultiverbar fylotype ved ≥98,5 % identitet ved bruk av HOMD 16S rRNA RefSeq, versjon 12.0 (http://www.homd.org) [28].

Sjeldne refaksjonskurver ble beregnet for å sammenligne mikrobiell rikdom [39]. Hovedkoordinatanalyse (PCoA) ble brukt for å evaluere den fylogenetiske beta-diversiteten [40] av bakterieprofilene på forskjellige tidspunkter. Multivariat partiell minste-kvadratanalyse (PLS)-modellering (SIMCA P+, versjon 12.0; Umetrics AB, Umeå, Sverige) ble utført for å søke om mikrobiotastrukturer var relatert til L. reuteri-forbruk (y-variabler) [41,42]. Testede modeller inkluderte de med kun pyrosekvenseringsdata og de som hadde blitt lagt til laktobaciller og streptokokkkultur og PCR-data. Variabler ble autoskalert til enhetsvarians og kryssvaliderte Y-prediksjoner ble beregnet. Emnegruppering ble vist i poengladningsplott, og viktigheten av hver x-variabel ble vist i innlastingsplott. Variabler, der 95 % KI av PLS-korrelasjonskoeffisienten ikke inkluderte null, ble ansett som statistisk signifikante [42]. Q2-verdien ga kapasiteten til x-variablene til å forutsi utfallet (test eller placebogruppetildeling). Univariate analyser av enkelttaksa ble ikke brukt på grunn av kombinasjonen av små grupper og et høyt antall gjentatte tester.