Probiotisk Lactobacillus Reuteri og oral mikrobiota (OMICI)

Etiske erklæringer Undersøgelsen blev godkendt af Regional Ethical Review Board i Umeå, Sverige (Dnr 2011-380-31M) og blev udført i overensstemmelse med principperne udtrykt i Helsinki-erklæringen. Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle deltagere.

Emner og studiedesign Raske voksne frivillige, i alderen 20-66 år, blandt studerende og ansatte ved det medicinske fakultet, Umeå Universitet, Sverige blev rekrutteret til et dobbeltblindt, randomiseret kontrolleret forsøg (RCT) gennem annoncer. Inklusionskriterier var en selvrapporteret sund status og ingen brug af antibiotika eller probiotiske produkter i 3 måneder forud for undersøgelsen. Baseret på tidligere undersøgelser vedrørende persistensen af ​​probiotiske stammer [31,32] var rekrutteringsmålet mindst 15 personer pr. undersøgelsesgruppe.

Fireogfyrre frivillige, hvoraf ingen brugte tobaksprodukter, blev rekrutteret og tilfældigt fordelt til enten en test (n = 22) eller placebogruppe (n = 22; figur S1). Deltagerne blev bedt om at lade 2 sugetabletter om dagen langsomt smelte i munden og cirkulere det opløste tabletindhold rundt om munden. En sugetablet blev taget om morgenen og 1 om aftenen i 12 uger. Testpastillerne indeholdt L. reuteri (DSM 17938 og PTA 5289; 108 CFU pr. stamme; BioGaia AB, Stockholm, Sverige), isomalt, hydrogeneret palmeolie, pebermynte- og mentolaroma, pebermynteolie og sucralose (http://www. biogaia.com/product/biogaia-prodentis-oral-pastiller). Placebo-pastillerne var identiske med testpastillerne i udseende, smag og sammensætning bortset fra lactobacilli. Overholdelse blev overvåget som procentdelen af ​​forbrugte pastiller af det samlede tildelte antal. De resterende pastiller blev talt, når beholderne blev returneret til månedlige genopfyldninger for at vurdere denne faktor. Overholdelse blev anset for acceptabel, hvis ≤15 % af sugetabletterne var tilbage. Deltagerne blev bedt om at afstå fra mundhygiejne i 48 timer og ikke at indtage mad i mindst 4 timer før prøvetagning. Deltagerne blev også instrueret i ikke at spise probiotiske produkter i hele undersøgelsesperioden.

Spyt- og biofilmprøvetagning Spyt- og tandbiofilmprøver blev taget umiddelbart før (baseline) og efter 4, 8 og 12 ugers L. reuteri-tilskud (figur S1). Opfølgningsprøver blev indsamlet 1 og 6 måneder efter, at tilskud var afsluttet. Endvidere blev hel stimuleret spyt (~5 ml) genereret ved at tygge 1 g paraffin og opsamlet i iskølede sterile reagensglas. En milliliter spyt blev brugt til kulturanalyse, og det resterende spyt blev centrifugeret ved 3.500 x g i 10 minutter ved 4°C. Pelleterne blev opbevaret ved -80°C indtil DNA-ekstraktion til stammespecifikke PCR-reaktioner. Til pyrosequencing-analysen blev poolet supragingival plak opsamlet med steriliserede tandstikkere og overført til Eppendorf-rør (Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland) indeholdende 200 µL TE-buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6). Prøverne blev opbevaret ved -80°C indtil DNA-ekstraktion.

Identifikation af lactobacilli ved dyrkning og PCR Alikvoter af spyt blev udpladet på Rogosa-agar (Merck, Darmstadt, Tyskland) for at opnå Lactobacillus-tællinger og på selektiv agar til foreløbig identifikation af L. reuteri (DSM 17938 og PTA 5289) stammerne [33]. Alle plader blev anaerobt inkuberet ved 37°C i 48-72 timer, undtagen L. reuteri PTA 5289, som blev anaerobt inkuberet ved 40°C i 72 timer.

DNA blev ekstraheret fra spytpiller som beskrevet [34]. L. reuteri DSM 17938 og PTA 5289-specifik PCR blev identificeret ved hjælp af KAPA2G Robust HotStart PCR Ready Mix (2×) (Kapa Biosystems, Boston, MA, USA) og stammespecifikke primere [31]. Kort fortalt blev 2 µL DNA-ekstrakt tilsat til et totalt reaktionsvolumen på 25 µL (indeholdende 12,5 µL mastermix og hvert primerpar i en koncentration på 0,5 µM). PCR-betingelser var 95°C i 3 minutter; 40 cyklusser af 95°C i 15 s, 60°C i 15 s og 72°C i 30 s; og 72°C i 5 min. PCR-produkter blev derefter verificeret ved elektroforese på 2 % agarosegeler, der fik lov til at køre i 80 minutter ved 120 V i 0,5 x TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer, pH 8,3, efterfulgt af ethidiumbromid (0,2 µg/µL) farvning.

Pyrosequencing-analyse Til 454 pyrosequencing-analysen blev 16 forsøgspersoner tilfældigt udvalgt blandt test- (n = 8) og kontrol- (n = 8) emner (figur S1). DNA blev ekstraheret fra basislinjen, 12-ugers eksponering og 1-måneders opfølgning af tandbiofilmprøver som tidligere beskrevet [34]. Den hypervariable V3-V4-region af 16S rRNA-genet blev amplificeret via PCR under anvendelse af den fremadrettede primer 347F og den omvendte primer 803R [35]. Til prøveidentifikation blev fusionsprimere skabt ud fra disse primere og unikke stregkodesekvenser i overensstemmelse med Roches retningslinjer for eksperimentelt amplikondesign (www.454.com). DNA blev amplificeret under følgende kørebetingelser: initial denaturering ved 94°C i 3 minutter; 30 cyklusser af 94ºC i 15 s, 58ºC i 15 s og 72ºC i 30 s; og en sidste forlængelse ved 72ºC i 8 min.

Amplicon-behandling og 454-sekventering blev udført på Lund University Sequencing Facility (Det Naturvidenskabelige Fakultet, Lund, Sverige). Efter amplikonrensning for at fjerne korte fragmenter (Agencourt AMPure XP; Beckman Coulter, Brea, CA, USA) og inspektion (DNA 1000 kit på en 2100 Bioanalyzer; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), blev amplikonerne kvantificeret (Quant-iT ds DNA assay kit; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA og Quantifluor fluorometer; Promega, Madison, WI, USA) og fortyndet for at opnå i alt 107 kopier/μL. Titrering og biblioteksproduktion (mål: 10%-15% berigelse) blev udført under anvendelse af emulsions-PCR og Lib-A-kittet (Roche Diagnostics, Branford, CT, USA). DNA-positive perler blev beriget, talt (Innovatis CASY partikeltæller; Roche Innovatis, Bielefeld, Tyskland), behandlet (XLR70 sekventeringskit; Roche Diagnostics) og sat på en picotiterplade til pyrosequencing på en 454 Life Sciences Genome Sequencer FLX+ maskine ( Roche Applied Sciences; Penzberg, Tyskland).

Databehandling Emnekarakteristik, overholdelse og kulturdata blev behandlet ved hjælp af SPSS (version 22.0; IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Beskrivende statistikker, såsom middelværdier [95 % konfidensintervaller (CI)] og andelsfordelinger blev beregnet. Forskelle mellem grupper blev testet med parametriske eller ikke-parametriske test afhængigt af datamåling og distributionsniveauer. P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Sekvenser med en minimumlængde på 300 basepar efter fjernelse af primersekvens, korrekte stregkodesekvenser, maksimalt 1 forkert basepar i primersekvenserne og overholdelse af standardkvalitetskriterierne for homopolymerer og kvalitetsscore i Quantitative Insights in Microbial Ecology ( QIIME) [36] softwarepakke (version 1.8.0) blev bevaret til analyse. Enhver sekvens ud over den omvendte primer blev fjernet. Sekvenser, der begynder med den omvendte primer, blev omvendt komplementeret. Sekvenser blev derefter grupperet i operationelle taksonomiske enheder (OTU'er) med en sekvenslighed på 97% i den 16S rRNA-kimærkontrollerede Greengene-database (dateret maj 2013) [37] ved hjælp af USEARCH [38]. OTU'er med en enkelt sekvens blev fjernet. En repræsentativ sekvens pr. resterende OTU blev taksonomisk tildelt som en navngivet eller unavngiven dyrkbar art eller ikke-dyrkbar fylotype ved ≥98,5 % identitet ved hjælp af HOMD 16S rRNA RefSeq, version 12.0 (http://www.homd.org) [28].

Sjældne refaktionskurver blev beregnet for at sammenligne mikrobiel rigdom [39]. Principal koordinatanalyse (PCoA) blev anvendt til at evaluere den fylogenetiske beta-diversitet [40] af bakterieprofilerne på forskellige tidspunkter. Multivariat partiel mindste kvadraters analyse (PLS) modellering (SIMCA P+, version 12.0; Umetrics AB, Umeå, Sverige) blev udført for at søge om mikrobiota strukturer var relateret til L. reuteri forbrug (y-variabler) [41,42]. Testede modeller inkluderede kun dem med pyrosekventeringsdata og dem, hvortil lactobacilli og streptokokker kultur og PCR-data var blevet tilføjet. Variabler blev autoskaleret til enhedsvarians, og krydsvaliderede Y-forudsigelser blev beregnet. Emnegruppering blev vist i score loading plots, og vigtigheden af ​​hver x-variabel blev vist i loading plots. Variabler, hvor 95% CI af PLS-korrelationskoefficienten ikke indeholdt nul, blev betragtet som statistisk signifikante [42]. Q2-værdien gav x-variablernes kapacitet til at forudsige resultatet (test eller placebogruppetildeling). Univariate analyser af enkelt taxa blev ikke anvendt på grund af kombinationen af ​​små grupper og et højt antal gentagne tests.