Probiótico Lactobacillus Reuteri y Microbiota Oral (OMICI)

Declaraciones de ética El estudio fue aprobado por la Junta Regional de Revisión Ética en Umeå, Suecia (Dnr 2011-380-31M) y se llevó a cabo de acuerdo con los principios expresados ​​en la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes.

Sujetos y diseño del estudio Voluntarios adultos sanos, de 20 a 66 años de edad, entre estudiantes y empleados de la Facultad de Medicina de la Universidad de Umeå, Suecia, fueron reclutados para un ensayo controlado aleatorio (ECA) doble ciego a través de anuncios. Los criterios de inclusión fueron un estado de salud autoinformado y no usar antibióticos o productos probióticos durante los 3 meses previos al estudio. Con base en estudios previos sobre la persistencia de cepas probióticas [31,32], el objetivo de reclutamiento fue de al menos 15 personas por grupo de estudio.

Cuarenta y cuatro voluntarios, ninguno de los cuales usaba productos de tabaco, fueron reclutados y asignados aleatoriamente a un grupo de prueba (n = 22) o placebo (n = 22; Figura S1). Se pidió a los participantes que permitieran que 2 pastillas al día se derritieran lentamente en la boca y que el contenido disuelto de las pastillas circulara por la boca. Se tomó una pastilla por la mañana y otra por la noche durante 12 semanas. Las pastillas de prueba contenían L. reuteri (DSM 17938 y PTA 5289; 108 CFU por cepa; BioGaia AB, Estocolmo, Suecia), isomalta, aceite de palma hidrogenado, saborizante de menta y mentol, aceite de menta y sucralosa (http://www. biogaia.com/product/biogaia-prodentis-oral-lozenges). Las pastillas de placebo eran idénticas a las pastillas de prueba en apariencia, sabor y composición excepto los lactobacilos. El cumplimiento se controló como el porcentaje de pastillas consumidas del número total asignado. Las pastillas restantes se contaron cuando se devolvieron los envases para recargas mensuales para evaluar este factor. El cumplimiento se consideró aceptable si quedaba ≤15% de las pastillas. Se pidió a los participantes que se abstuvieran de la higiene bucal durante 48 horas y que no consumieran ningún alimento durante al menos 4 horas antes de la toma de muestras. También se indicó a los participantes que no comieran productos probióticos durante el período de estudio.

Muestreo de saliva y biopelícula Las muestras de saliva y biopelícula dental se obtuvieron inmediatamente antes (línea de base) y después de 4, 8 y 12 semanas de suplementación con L. reuteri (Figura S1). Se recogieron muestras de seguimiento 1 y 6 meses después de terminar la suplementación. Además, se generó saliva entera estimulada (~5 ml) al masticar 1 g de parafina y se recogió en tubos de ensayo estériles enfriados con hielo. Se usó un mililitro de saliva para el análisis de cultivo y la saliva restante se centrifugó a 3500 × g durante 10 min a 4 °C. Los sedimentos se almacenaron a -80 °C hasta la extracción de ADN para las reacciones de PCR específicas de la cepa. Para el análisis de pirosecuenciación, la placa supragingival agrupada se recogió con palillos de dientes esterilizados y se transfirió a tubos Eppendorf (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania) que contenían 200 µl de tampón TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6). Las muestras se almacenaron a -80°C hasta la extracción de ADN.

Identificación de lactobacilos por cultivo y PCR Se sembraron alícuotas de saliva en agar Rogosa (Merck, Darmstadt, Alemania) para obtener recuentos de Lactobacillus y en agar selectivo para la identificación tentativa de las cepas de L. reuteri (DSM 17938 y PTA 5289) [33]. Todas las placas se incubaron anaeróbicamente a 37 °C durante 48-72 h, excepto L. reuteri PTA 5289, que se incubó anaeróbicamente a 40 °C durante 72 h.

El ADN se extrajo de los gránulos de saliva como se describe [34]. La PCR específica de L. reuteri DSM 17938 y PTA 5289 se identificó utilizando KAPA2G Robust HotStart PCR Ready Mix (2x) (Kapa Biosystems, Boston, MA, EE. UU.) y cebadores específicos de cepa [31]. Brevemente, se añadieron 2 µL de extracto de ADN a un volumen de reacción total de 25 µL (que contenía 12,5 µL de mezcla maestra y cada par de cebadores a una concentración de 0,5 µM). Las condiciones de la PCR fueron 95 °C durante 3 min; 40 ciclos de 95°C por 15 s, 60°C por 15 s, y 72°C por 30 s; y 72°C durante 5 min. Luego, los productos de la PCR se verificaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 2 % que se dejaron correr durante 80 min a 120 V en tampón 0,5x TBE (Tris/borato/EDTA), pH 8,3, seguido de tinción con bromuro de etidio (0,2 µg/µl).

Análisis de pirosecuenciación Para el análisis de pirosecuenciación 454, se seleccionaron aleatoriamente 16 sujetos entre los sujetos de prueba (n = 8) y de control (n = 8) (Figura S1). El ADN se extrajo de las muestras de biopelícula dental de referencia, exposición de 12 semanas y seguimiento de 1 mes como se describió anteriormente [34]. La región hipervariable V3-V4 del gen 16S rRNA se amplificó mediante PCR utilizando el cebador directo 347F y el cebador inverso 803R [35]. Para la identificación de muestras, se crearon cebadores de fusión a partir de estos cebadores y secuencias de código de barras únicas de acuerdo con las directrices de Roche para el diseño de amplicones experimentales (www.454.com). El ADN se amplificó en las siguientes condiciones de funcionamiento: desnaturalización inicial a 94 °C durante 3 min; 30 ciclos de 94ºC por 15 s, 58ºC por 15 s, y 72ºC por 30 s; y una extensión final a 72ºC durante 8 min.

El procesamiento de amplicón y la secuenciación 454 se realizaron en el Centro de secuenciación de la Universidad de Lund (Facultad de Ciencias, Lund, Suecia). Después de la limpieza de los amplicones para eliminar los fragmentos cortos (Agencourt AMPure XP; Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.) y la inspección (kit DNA 1000 en un Bioanalyzer 2100; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE. kit de ensayo de ADN ds; Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU. y fluorómetro Quantifluor; Promega, Madison, WI, EE. UU.) y se diluyó para obtener un total de 107 copias/μL. La titulación y la producción de bibliotecas (objetivo: 10 %-15 % de enriquecimiento) se realizaron mediante PCR en emulsión y el kit Lib-A (Roche Diagnostics, Branford, CT, EE. UU.). Las perlas con ADN positivo se enriquecieron, se contaron (contador de partículas Innovatis CASY; Roche Innovatis, Bielefeld, Alemania), se procesaron (kit de secuenciación XLR70; Roche Diagnostics) y se cargaron en una placa de picotitulación para pirosecuenciación en una máquina 454 Life Sciences Genome Sequencer FLX+ ( Roche Applied Sciences; Penzberg, Alemania).

Procesamiento de datos Los datos de características, cumplimiento y cultivo de los sujetos se procesaron con SPSS (versión 22.0; IBM Corporation, Armonk, NY, EE. UU.). Se calcularon estadísticas descriptivas, como medias [intervalos de confianza (IC) del 95%] y distribuciones de proporciones. Las diferencias entre los grupos se probaron con pruebas paramétricas o no paramétricas según los niveles de medición y distribución de datos. P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Secuencias con una longitud mínima de 300 pares de bases después de la eliminación de la secuencia del cebador, secuencias de código de barras correctas, un máximo de 1 par de bases incorrecto en las secuencias del cebador y cumplimiento de los criterios de calidad predeterminados para homopolímeros y puntajes de calidad en Quantitative Insights into Microbial Ecology ( QIIME) [36] paquete de software (versión 1.8.0) se conservaron para el análisis. Se eliminó cualquier secuencia más allá del cebador invertido. Las secuencias que comenzaban con el cebador inverso se complementaron inversamente. Luego, las secuencias se agruparon en unidades taxonómicas operativas (OTU) con una similitud de secuencia del 97% en la base de datos Greengene verificada por quimeras 16S rRNA (con fecha de mayo de 2013) [37] usando USEARCH [38]. Se eliminaron las OTU con una sola secuencia. Una secuencia representativa por OTU restante se asignó taxonómicamente como una especie cultivable con nombre o sin nombre o un filotipo no cultivable con una identidad de ≥98,5 % utilizando HOMD 16S rRNA RefSeq, versión 12.0 (http://www.homd.org) [28].

Se calcularon curvas de rarefacción para comparar la riqueza microbiana [39]. Se aplicó el análisis de coordenadas principales (PCoA) para evaluar la diversidad beta filogenética [40] de los perfiles bacterianos en diferentes momentos. Se realizó un modelo de análisis de mínimos cuadrados parciales (PLS) multivariado (SIMCA P+, versión 12.0; Umetrics AB, Umeå, Suecia) para buscar si las estructuras de la microbiota estaban relacionadas con el consumo de L. reuteri (variables y) [41,42]. Los modelos probados incluyeron aquellos con datos de pirosecuenciación únicamente y aquellos a los que se les había agregado cultivo de lactobacilos y estreptococos y datos de PCR. Las variables se escalaron automáticamente a la varianza de la unidad y se calcularon las predicciones Y con validación cruzada. El agrupamiento de sujetos se mostró en gráficos de carga de puntuación, y la importancia de cada variable x se mostró en gráficos de carga. Las variables en las que el IC del 95% del coeficiente de correlación PLS no incluía cero se consideraron estadísticamente significativas [42]. El valor de Q2 arrojó las capacidades de las variables x para predecir el resultado (asignación de grupo de prueba o placebo). No se aplicaron análisis univariados de taxones individuales debido a la combinación de grupos pequeños y una gran cantidad de pruebas repetidas.