Probiotischer Lactobacillus Reuteri und orale Mikrobiota (OMICI)

Ethikerklärungen Die Studie wurde vom Regional Ethical Review Board in Umeå, Schweden (Dnr 2011-380-31M) genehmigt und gemäß den in der Deklaration von Helsinki zum Ausdruck gebrachten Grundsätzen durchgeführt. Von allen Teilnehmern wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

Probanden und Studiendesign Gesunde erwachsene Freiwillige im Alter von 20 bis 66 Jahren unter Studenten und Mitarbeitern der Medizinischen Fakultät der Universität Umeå, Schweden, wurden über Anzeigen für eine doppelblinde, randomisierte kontrollierte Studie (RCT) rekrutiert. Einschlusskriterien waren ein selbstberichteter Gesundheitszustand und keine Verwendung von Antibiotika oder probiotischen Produkten in den 3 Monaten vor der Studie. Basierend auf früheren Studien zur Persistenz probiotischer Stämme [31,32] war das Rekrutierungsziel mindestens 15 Personen pro Studiengruppe.

Vierundvierzig Freiwillige, von denen keiner Tabakprodukte verwendete, wurden rekrutiert und nach dem Zufallsprinzip entweder einer Test- (n = 22) oder einer Placebogruppe (n = 22; Abbildung S1) zugeteilt. Die Teilnehmer wurden gebeten, 2 Lutschtabletten pro Tag langsam im Mund zergehen zu lassen und den aufgelösten Tabletteninhalt im Mund zu zirkulieren. 12 Wochen lang wurde eine Lutschtablette morgens und eine abends eingenommen. Die Testpastillen enthielten L. reuteri (DSM 17938 und PTA 5289; 108 KBE pro Stamm; BioGaia AB, Stockholm, Schweden), Isomalt, hydriertes Palmöl, Pfefferminz- und Mentholaroma, Pfefferminzöl und Sucralose (http://www. biogaia.com/product/biogaia-prodentis-oral-lozenges). Die Placebo-Lutschtabletten waren mit Ausnahme der Laktobazillen in Aussehen, Geschmack und Zusammensetzung mit den Test-Lutschtabletten identisch. Die Einhaltung wurde als Prozentsatz der verbrauchten Lutschtabletten an der zugewiesenen Gesamtzahl überwacht. Die verbleibenden Lutschtabletten wurden gezählt, als die Behälter zum monatlichen Nachfüllen zurückgegeben wurden, um diesen Faktor zu bewerten. Die Compliance wurde als akzeptabel angesehen, wenn ≤ 15 % der Lutschtabletten zurückblieben. Die Teilnehmer wurden gebeten, vor der Probenahme 48 h lang auf Mundhygiene zu verzichten und mindestens 4 h lang keine Nahrung zu sich zu nehmen. Die Teilnehmer wurden außerdem angewiesen, während des gesamten Studienzeitraums keine probiotischen Produkte zu sich zu nehmen.

Speichel- und Biofilmproben Speichel- und Zahnbiofilmproben wurden unmittelbar vor (Basislinie) und nach 4, 8 und 12 Wochen der L. reuteri-Supplementierung entnommen (Abbildung S1). Follow-up-Proben wurden 1 und 6 Monate nach Beendigung der Supplementierung entnommen. Darüber hinaus wurde vollständiger stimulierter Speichel (~5 ml) durch Kauen von 1 g Paraffin erzeugt und in eisgekühlten sterilen Reagenzgläsern gesammelt. Ein Milliliter Speichel wurde für die kulturelle Analyse verwendet, und der verbleibende Speichel wurde bei 3.500 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Die Pellets wurden bis zur DNA-Extraktion für stammspezifische PCR-Reaktionen bei –80°C gelagert. Für die Pyrosequenzierungsanalyse wurde gepoolte supragingivale Plaque mit sterilisierten Zahnstochern gesammelt und in Eppendorf-Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) überführt, die 200 &mgr;l TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6) enthielten. Die Proben wurden bis zur DNA-Extraktion bei –80°C gelagert.

Identifizierung von Laktobazillen durch Kultur und PCR Aliquots von Speichel wurden auf Rogosa-Agar (Merck, Darmstadt, Deutschland) plattiert, um Lactobacillus-Zählungen zu erhalten, und auf selektivem Agar zur vorläufigen Identifizierung der Stämme von L. reuteri (DSM 17938 und PTA 5289) [33]. Alle Platten wurden 48–72 h lang bei 37°C anaerob inkubiert, mit Ausnahme von L. reuteri PTA 5289, das 72 h lang bei 40°C anaerob inkubiert wurde.

DNA wurde wie beschrieben aus Speichelpellets extrahiert [34]. L. reuteri DSM 17938 und PTA 5289-spezifische PCR wurden mit KAPA2G Robust HotStart PCR Ready Mix (2×) (Kapa Biosystems, Boston, MA, USA) und stammspezifischen Primern identifiziert [31]. Kurz gesagt wurden 2 &mgr;l DNA-Extrakt zu einem Gesamtreaktionsvolumen von 25 &mgr;l (enthaltend 12,5 &mgr;l Mastermix und jedes Primerpaar in einer Konzentration von 0,5 &mgr;M) zugegeben. Die PCR-Bedingungen waren 95°C für 3 min; 40 Zyklen von 95°C für 15 s, 60°C für 15 s und 72°C für 30 s; und 72°C für 5 min. Die PCR-Produkte wurden dann durch Elektrophorese auf 2 % Agarosegelen verifiziert, die 80 min lang bei 120 V in 0,5 × TBE (Tris/Borat/EDTA)-Puffer, pH 8,3, laufen gelassen wurden, gefolgt von einer Färbung mit Ethidiumbromid (0,2 µg/µl).

Pyrosequenzierungsanalyse Für die 454 Pyrosequenzierungsanalyse wurden 16 Probanden zufällig aus den Test- (n = 8) und Kontrollpersonen (n = 8) ausgewählt (Abbildung S1). DNA wurde aus den Zahnbiofilmproben der Grundlinie, der 12-wöchigen Exposition und der 1-Monats-Follow-up-Probe wie zuvor beschrieben extrahiert [34]. Die hypervariable Region V3-V4 des 16S-rRNA-Gens wurde über PCR unter Verwendung des Vorwärtsprimers 347F und des Rückwärtsprimers 803R amplifiziert [35]. Zur Probenidentifizierung wurden Fusionsprimer aus diesen Primern und eindeutigen Barcodesequenzen gemäß den Roche-Richtlinien für experimentelles Amplikondesign (www.454.com) erstellt. Die DNA wurde unter den folgenden Laufbedingungen amplifiziert: anfängliche Denaturierung bei 94°C für 3 min; 30 Zyklen mit 94 °C für 15 s, 58 °C für 15 s und 72 °C für 30 s; und eine abschließende Verlängerung bei 72°C für 8 min.

Amplikon-Verarbeitung und 454-Sequenzierung wurden an der Lund University Sequencing Facility (Naturwissenschaftliche Fakultät, Lund, Schweden) durchgeführt. Nach der Amplikon-Reinigung zur Entfernung kurzer Fragmente (Agencourt AMPure XP; Beckman Coulter, Brea, CA, USA) und Inspektion (DNA 1000-Kit auf einem 2100 Bioanalyzer; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) wurden die Amplikons quantifiziert (Quant-iT ds DNA Assay Kit; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA und Quantifluor Fluorometer; Promega, Madison, WI, USA) und verdünnt, um insgesamt 107 Kopien/μl zu erhalten. Titration und Bibliothekserstellung (Ziel: 10 %–15 % Anreicherung) wurden unter Verwendung von Emulsions-PCR und dem Lib-A-Kit (Roche Diagnostics, Branford, CT, USA) durchgeführt. DNA-positive Kügelchen wurden angereichert, gezählt (Innovatis CASY-Partikelzähler; Roche Innovatis, Bielefeld, Deutschland), verarbeitet (XLR70-Sequenzierungskit; Roche Diagnostics) und auf eine Picotiter-Platte für die Pyrosequenzierung auf einer 454 Life Sciences Genome Sequencer FLX+-Maschine geladen ( Roche Applied Sciences, Penzberg, Deutschland).

Datenverarbeitung Daten zu Patientenmerkmalen, Compliance und Kultur wurden mit SPSS (Version 22.0; IBM Corporation, Armonk, NY, USA) verarbeitet. Beschreibende Statistiken wie Mittelwerte [95 % Konfidenzintervalle (KI)] und Anteilsverteilungen wurden berechnet. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden je nach Datenmessung und Verteilungsebenen mit parametrischen oder nichtparametrischen Tests getestet. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Sequenzen mit einer Mindestlänge von 300 Basenpaaren nach Entfernen der Primersequenz, korrekte Barcodesequenzen, maximal 1 falsches Basenpaar in den Primersequenzen und Einhaltung der Standardqualitätskriterien für Homopolymere und Qualitäts-Scores in den Quantitative Insights into Microbial Ecology ( QIIME) [36] Softwarepaket (Version 1.8.0) wurden zur Analyse zurückbehalten. Jegliche Sequenz jenseits des reversed Primers wurde entfernt. Sequenzen, die mit dem Reverse-Primer beginnen, wurden revers komplementiert. Die Sequenzen wurden dann in Operational Taxonomic Units (OTUs) mit einer Sequenzähnlichkeit von 97 % in der 16S-rRNA-Chimären-geprüften Greengene-Datenbank (vom Mai 2013) [37] unter Verwendung von USEARCH [38] geclustert. OTUs mit einer einzelnen Sequenz wurden entfernt. Eine repräsentative Sequenz pro verbleibender OTU wurde taxonomisch als benannte oder unbenannte kultivierbare Art oder nicht kultivierbarer Phylotyp mit ≥98,5 % Identität unter Verwendung von HOMD 16S rRNA RefSeq, Version 12.0 (http://www.homd.org) zugeordnet. [28].

Verdünnungskurven wurden berechnet, um den mikrobiellen Reichtum zu vergleichen [39]. Die Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) wurde angewendet, um die phylogenetische Beta-Diversität [40] der Bakterienprofile zu verschiedenen Zeitpunkten zu bewerten. Es wurde eine multivariate Partial-Least-Square-Analyse (PLS)-Modellierung (SIMCA P+, Version 12.0; Umetrics AB, Umeå, Schweden) durchgeführt, um zu suchen, ob Mikrobiota-Strukturen mit dem Verzehr von L. reuteri zusammenhängen (y-Variablen) [41,42]. Zu den getesteten Modellen gehörten solche mit nur Pyrosequenzierungsdaten und solche, denen Lactobazillen- und Streptokokkenkultur- und PCR-Daten hinzugefügt wurden. Variablen wurden automatisch auf Einheitsvarianz skaliert und kreuzvalidierte Y-Vorhersagen wurden berechnet. Subjekt-Clustering wurde in Score-Loading-Plots angezeigt, und die Wichtigkeit jeder x-Variablen wurde in Loading-Plots angezeigt. Variablen, bei denen das 95 %-KI des PLS-Korrelationskoeffizienten nicht Null enthielt, wurden als statistisch signifikant angesehen [42]. Der Q2-Wert ergab die Kapazitäten der x-Variablen, das Ergebnis (Test- oder Placebo-Gruppenzuordnung) vorherzusagen. Univariate Analysen einzelner Taxa wurden aufgrund der Kombination kleiner Gruppen und einer hohen Anzahl von Wiederholungstests nicht durchgeführt.