分枝鎖アミノ酸への慢性的な食事曝露の影響

対象と方法 他に記載 介入 他に記載

臨床検査 各被験者は、人体測定検査（身長（m）、体重（kg）、BMI（kg/m2）、腹囲（cm）、ウエストヒップ比）を含む基本的な健康診断を受けました。 体組成は、生体インピーダンス分析（BIA、Nutriguard-M、Data Input GmbH、ドイツ）を使用して測定されました。 上記の各測定を 3 回実行し、平均値を記録しました。

食事の評価 各参加者は、3 日間 (2 営業日、1 週末) の食事データが収集された前向きアンケートに記入しました。 食事摂取量の計算には、Nutridan プログラムが使用されました。 一部の特別なビーガン製品の栄養データはデータベースで入手できないため、ビーガンはこれらの製品から生産者が宣言した栄養成分を含むパッケージを収集するよう求められ、これらのデータが計算に使用されました. 糖類、脂質、タンパク質の摂取量は別々に計算されました。 食物タンパク質のBCAA含有量は、栄養データベースを使用して推定されました。

身体活動の評価 身体活動は、最大酸素消費量 (VO2max) [2] とよく相関する習慣的な身体活動 [1] に関する Baecke アンケートを使用して、サンプル全体で評価されました。 最大酸素摂取量（Vo2peak）を決定するために、電磁ブレーキ付き自転車エルゴメーター（Ergoline 800、Bitz、Germany）で各被験者に最大運動試験を実施しました。 口頭での励ましにも関わらず、最初の 50W のワークロードは、疲労するまで継続的に 1 分ごとに 25W ずつ増加しました。 酸素摂取量は、Vmax、Sensor Medics (Yorba Linda、CA) を使用して測定しました。 心拍数は継続的に監視されました。

検査室での分析 12 時間の絶食後、各被験者から末梢静脈血を採取しました。 グルコース恒常性のパラメーターは、認定された大学病院の研究室で評価されました：ヘキソキナーゼ反応（キットKONELAB、ドイツ）を使用した血漿グルコース、高圧液体ボロネートアフィニットクロマトグラフィー（Primus Corporation）を使用したHbA1c、固相競合化学発光酵素イムノアッセイ（Immulite 2000）を使用したインスリン. 脂質プロファイル：総コレステロールとトリグリセリドは酵素法（kit KONELAB、ドイツ）を使用して測定し、HDL-コレステロールはPEG修飾酵素測定（kit ROCHE、スイス）を使用して測定しました。 遊離脂肪酸 (FFA) の血漿レベルは、既に説明されている方法を使用して測定されました [12]。 簡単に言えば、イソオクタンを使用してFFAを中性脂質と一緒に抽出し、逆抽出により洗浄しました。 このようにして得られた FA をメチルエステルに誘導体化し、続いてガスクロマトグラフィー (GC) を使用して分析しました。 血清 AA レベルは、非接触導電率検出を備えたキャピラリー電気泳動 (CE) を使用して決定されました。これについては、既に詳細に説明されています [3、4]。 CE測定は、非接触導電率検出器を内蔵したHP3DCEシステム（Agilent Technologies、Waldbronn、Germany）を使用して実行されました。

インスリン感受性および分泌 IS は、2 時間の高インスリン正常血糖クランプを使用して評価されました。 クランプは、標準インスリン用量１ｍＩＵ／ｋｇ／分で１２時間の絶食後に実施され、１５％グルコース溶液の注入が使用された。 測定には、クランプの定常状態での平均注入速度 (6 回の連続測定) を使用しました。 グルコース処理は、代謝クリアランス率（MCR、ml.kg-1.min-1）として表されました 細胞外液中のグルコースプールの変化を補正した後（スペース補正）およびインスリン感受性指数（MCRを定常状態のインスリン血症で割った値、MCR/I、ml.kg-1.min-1/mU.l-1）。 インスリン分泌は、グルコースクランプとは異なる日（その間の約７日）に実施された、既に記載された［６］ＩＶアルギニン試験によって評価された。 急性インスリン応答は、試験の 30 分間のインスリンの増加する台形面積として計算されました。

筋肉生検、呼吸鎖、およびクエン酸シンターゼ酵素活性 外側広筋からの骨格筋サンプルは、標準的な Bergström 法を使用してすべての参加者で実施されました [7, 8]。 生検は絶食状態で行った。 約２００ｍｇの湿重量が得られた。 サンプルを直ちに顕微解剖し、重量を測定し、それぞれの分析用に分割し、液体窒素で急速冷凍し、分析まで-80℃で保存しました。

ミトコンドリア呼吸鎖 (RC) 酵素活性とクエン酸シンターゼ (CS) 活性は、筋肉ホモジネートで分光光度法で測定されました。 筋肉ホモジネートは、記載されているように調製した[9]。 簡単に説明すると、約 50 mg の SM を小さな断片に切断し、20 倍量の氷冷ホモジナイゼーション バッファー (250 mM スクロース、20 mM Tris、40 mM KCl、2 mM EGTA、プロテアーゼ阻害剤カクテル、 pH 7.4)。 次いでホモジネートを４℃、６００ｇで１分間遠心分離し、上清を直ちに分析に使用した。 タンパク質濃度は、ビシンコニン酸 (BCA) アッセイ (Sigma) を使用してアリコートで測定しました。 複合体 I-IV および CS の活性は、マイクロプレート リーダー (Infinite M200 PRO、Tecan) での測定用に変更された、以前に公開されたプロトコル [10-11] に従って決定されました。 すべての測定は 4 連で行われました。 RC および CS の活性は、総タンパク質の Δ log (A550)/分/mg として表される複合体 IV を除いて、総タンパク質の nmol/分/mg として表されました。 RC複合体の酵素活性は、組織内のミトコンドリアの豊富さのマーカーとして使用されるCSの活性に対しても正規化されました。

脂肪組織生検 皮下腹部脂肪組織（SAAT）生検は、すべての参加者で実施されました。 Bergström 針は、既に説明したように、傍臍部から皮下脂肪のサンプルを採取するために使用されました [12]。 生検は絶食状態で行った。 約３００ｍｇの湿重量が得られた。 サンプルを直ちに顕微解剖し、重量を測定し、それぞれの分析用に分割し、液体窒素で急速冷凍し、分析まで-80℃で保存しました。

定量的リアルタイム PCR (RT-qPCR) 脂質組織および線維組織 RNeasy Mini Kits (Qiagen) を使用して、組織からの全 RNA を分離しました。 RNA濃度は、Nanodrop1000（Thermo Fisher Scientific、ウィルミントン、米国）によって測定されました。 RNA を DNAse I (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) で処理して、混入しているゲノム DNA を除去しました。 High Capacity cDNA アーカイブ キット (Applied Biosystems, Carlsbad CA, USA) を使用して、200 ～ 600 ng の RNA から cDNA を調製しました。 Fast Advanced マスター ミックスおよび遺伝子発現アッセイ (IRS1、GLUT4、BCKDHA、BCKDHB、ACOX、CPT1b、PLIN1、PLIN2、PLIN5、FASN、SCD1、DGAT2、PPAR-γ) を使用したリアルタイム PCR 反応には、5 ng 相当の RNA を使用しました。 ; アプライド バイオシステムズ)。 すべてのサンプルは重複して実行されました。 標的遺伝子の遺伝子発現をＲＰＳ１３（グルクロニダーゼ、ベータ）の発現に対して正規化し、デルタデルタＣｔ法を用いて発現の倍率変化を計算した。

AT における脂肪酸スペクトル AT における脂肪酸スペクトルは、ガスクロマトグラフィーを使用して評価されました。 [14] 簡単に言えば、この方法では、凍結乾燥した AT をクロロホルム/メタノールで抽出して脂質を分離し、続いて脂質に結合した FA をエステル交換またはエステル化してメチルエステルを形成し、ガスクロマトグラフィーを使用して分析しました。

統計分析 データは、テキスト、表、および図で示され、95 % CI および p 値 <0.05 で平均値 ± SD が統計的に有意であると見なされました。 スチューデント t 検定は、正規分布データの観測サンプルで使用されました。 データが正規分布していない場合は、ウィルコクソンの対応ペア検定が使用されました。 介入サンプルは、一般的な線形モデルを使用して比較され、グループ間の違いの統計的有意性がテストされました。 混合モデルANOVAを使用して、グループ×時間の相互作用を評価しました。 各グループ内で、介入の時間効果は、ボンフェローニの多重比較による反復測定 ANOVA を使用して評価されました。 各グループ内に 2 つのデータ セットしかない場合 (つまり、 組織生検から得られたデータのように、ベースラインと介入データのみ）正規分布データには対応のある t 検定を使用し、データが正規分布していない場合はウィルコクソン検定を使用しました。 ピアソンの相関係数は、正規分布データのベースラインから介入までの変化の関係を表すために計算され、データが正規分布していない場合はスピアマンの相関係数が計算されました。 Statistica 9.0、StatSoft, Inc. USA を使用して、すべての統計手順を実行しました。