Efectos de la exposición dietética crónica a los aminoácidos de cadena ramificada

Sujetos y métodos Enumerados en otra parte Intervención Enumerados en otra parte

Examen clínico A cada sujeto se le realizó un chequeo médico básico con examen antropométrico (talla (m), peso (kg), IMC (kg/m2), perímetro de cintura (cm), relación cintura-cadera). La composición corporal se midió mediante análisis de bioimpedancia (BIA, Nutriguard-M, Data Input GmbH, Alemania). Cada una de las medidas mencionadas anteriormente se realizó tres veces y se registró la media.

Valoración dietética Cada participante rellenó un cuestionario prospectivo, donde se recogieron datos dietéticos de 3 días (2 días laborables, 1 día de fin de semana). Para los cálculos de la ingesta dietética se utilizó el programa Nutridan. Dado que los datos nutricionales de algunos productos veganos especiales no están disponibles en la base de datos, se pidió a los veganos que recolectaran paquetes de estos productos con contenido nutricional declarado por el productor, y estos datos se usaron para los cálculos. La ingesta de sacáridos, lípidos y proteínas se calculó por separado. El contenido de BCAA de las proteínas de la dieta se estimó utilizando una base de datos nutricional.

Evaluación de la actividad física La actividad física se evaluó en toda la muestra utilizando el cuestionario de Baecke para la actividad física habitual [1], que se correlaciona bien con el consumo máximo de oxígeno (VO2max) [2]. Se realizó una prueba de esfuerzo máximo en cada sujeto en una bicicleta ergométrica con freno electromagnético (Ergoline 800, Bitz, Alemania) para determinar el consumo máximo de oxígeno (Vo2peak). Una carga de trabajo inicial de 50 W se incrementó en 25 W cada minuto de forma continua hasta la fatiga a pesar del estímulo verbal. El consumo de oxígeno se midió usando Vmax, Sensor Medics (Yorba Linda, CA). La frecuencia cardíaca se controló continuamente.

Análisis de laboratorio Se extrajo sangre venosa periférica de cada sujeto después de 12 horas de ayuno. Los parámetros de la homeostasis de la glucosa se evaluaron en el laboratorio de un hospital universitario certificado: glucosa plasmática usando la reacción de hexoquinasa (kit KONELAB, Alemania), HbA1c usando cromatografía afinita de boronato líquido de alta presión (Primus corporation), insulina usando inmunoensayo enzimático quimioluminiscente competitivo en fase sólida (Immulite 2000) . Perfil de lípidos: el colesterol total y los triglicéridos se midieron mediante el método enzimático (kit KONELAB, Alemania), el colesterol HDL mediante la medición enzimática modificada con PEG (kit ROCHE, Suiza). Los niveles plasmáticos de ácidos grasos libres (FFA) se midieron utilizando el método ya descrito [12]. Brevemente, los FFA se extrajeron junto con lípidos neutros utilizando isooctano y se limpiaron mediante extracción inversa. Los AG obtenidos de esta manera se derivatizaron a ésteres metílicos y posteriormente se analizaron mediante cromatografía de gases (GC). Los niveles séricos de AA se determinaron mediante electroforesis capilar (CE) con detección de conductividad sin contacto, que ya se ha descrito en detalle [3, 4]. Las mediciones de CE se llevaron a cabo utilizando el sistema HP3DCE (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) equipado con un detector de conductividad sin contacto incorporado.

La sensibilidad a la insulina y el IS de secreción se evaluaron utilizando un pinzamiento euglucémico hiperinsulinémico de 2 horas, método descrito en otra parte [5]. El pinzamiento se realizó en ayunas de 12 horas en dosis estándar de insulina 1mUI/kg/min y se utilizó una infusión de solución glucosada al 15 %. Para las mediciones se utilizó la tasa de infusión media en estado estacionario de la pinza (6 mediciones consecutivas). La eliminación de glucosa se expresó como tasa de depuración metabólica (MCR, ml.kg-1.min-1) después de la corrección de los cambios en la reserva de glucosa en el líquido extracelular (corrección de espacio) y el índice de sensibilidad a la insulina (MCR dividido por la insulina en estado estacionario, MCR/I, ml.kg-1.min-1/mU.l-1). La secreción de insulina se evaluó mediante la prueba de arginina IV como ya se describió [6] realizada en un día diferente (alrededor de 7 días en el medio) del pinzamiento de glucosa. La respuesta aguda a la insulina se calculó como el área trapezoidal incremental de la insulina durante los 30 minutos de la prueba.

Biopsia muscular, cadena respiratoria y actividad de las enzimas citrato sintasa Se realizó una muestra de músculo esquelético del músculo vastus lateralis en cada participante utilizando una técnica estándar de Bergström [7, 8]. La biopsia se realizó en condiciones de ayuno. Se obtuvieron aproximadamente 200 mg de peso húmedo. La muestra fue inmediatamente microdisectada, pesada, dividida para los respectivos análisis y ultracongelada en nitrógeno líquido y almacenada a -80oC hasta los análisis.

La actividad enzimática de la cadena respiratoria mitocondrial (RC) y la actividad de la citrato sintasa (CS) se midieron espectrofotométricamente en homogeneizados musculares. Los homogeneizados musculares se prepararon como se describe [9]. Brevemente, alrededor de 50 mg de SM se cortaron en pequeños fragmentos y se homogeneizaron (molinillo de vidrio-vidrio) en 20 volúmenes de tampón de homogeneización enfriado con hielo (sacarosa 250 mM, Tris 20 mM, KCl 40 mM, EGTA 2 mM, cóctel inhibidor de proteasa, pH 7,4). A continuación, los homogeneizados se centrifugaron durante 1 min a 600 ga 4 °C y los sobrenadantes se utilizaron inmediatamente para el análisis. La concentración de proteína se midió en alícuotas usando el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (Sigma). La actividad del complejo I-IV y CS se determinó de acuerdo con los protocolos publicados previamente [10-11], que se modificaron para la medición en un lector de microplacas (Infinite M200 PRO, Tecan). Todas las medidas se realizaron en tetraplicados. Las actividades de RC y CS se expresaron como nmol/min/mg de proteínas totales, excepto para el complejo IV, que se expresó como Δ log (A550)/min/mg de proteínas totales. Las actividades enzimáticas de los complejos RC también se normalizaron a la actividad de CS, que se utiliza como marcador de la abundancia de mitocondrias dentro de un tejido.

Biopsia de tejido adiposo Se realizó biopsia de tejido adiposo abdominal subcutáneo (SAAT) en todos los participantes. Se usó la aguja de Bergström para obtener muestras de grasa subcutánea del área paraumbilical como ya se describió [12]. La biopsia se realizó en condiciones de ayuno. Se obtuvieron aproximadamente 300 mg de peso húmedo. La muestra fue inmediatamente microdisectada, pesada, dividida para los respectivos análisis y ultracongelada en nitrógeno líquido y almacenada a -80oC hasta los análisis.

PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) El ARN total de los tejidos se aisló usando los Mini Kits RNeasy de Tejido Lípido y Tejido Fibroso (Qiagen). La concentración de ARN se midió con Nanodrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, EE. UU.). El ARN se trató con ADNasa I (Invitrogen, Carlsbad CA, EE. UU.) para eliminar cualquier ADN genómico contaminante. El ADNc se preparó a partir de 200-600 ng de ARN utilizando el kit de archivo de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Carlsbad CA, EE. UU.). Se usó el equivalente de 5 ng de ARN para las reacciones de PCR en tiempo real usando la mezcla maestra Fast Advanced y el ensayo de expresión génica (IRS1, GLUT4, BCKDHA, BCKDHB, ACOX, CPT1b, PLIN1, PLIN2, PLIN5, FASN, SCD1, DGAT2, PPAR-γ ; Biosistemas Aplicados). Todas las muestras se analizaron por duplicado. La expresión génica de los genes diana se normalizó a la expresión de RPS13 (glucuronidasa, beta) y se calculó el cambio de expresión utilizando el método delta delta Ct.

Espectro de ácidos grasos en AT El espectro de ácidos grasos en AT se evaluó mediante cromatografía de gases, un método ya descrito por Lepage y Roy [13] con modificaciones de Rodríguez-Palmero et al. [14] En resumen, el método implica una extracción con cloroformo/metanol de AT liofilizado para aislar lípidos y la posterior transesterificación o esterificación de FA unido a lípidos para formar ésteres metílicos, que luego se analizaron mediante cromatografía de gases.

Análisis estadístico Los datos se presentan en texto, tablas y figuras como medias ± DE con un IC del 95 % y los valores de p <0,05 se consideraron estadísticamente significativos. La prueba t de Student se utilizó en muestras de observación para datos distribuidos normalmente. Se utilizó la prueba de pares emparejados de Wilcoxon cuando los datos no tenían una distribución normal. Las muestras de intervención se compararon mediante un modelo lineal general para probar la significación estadística de las diferencias entre los grupos. Se utilizó un ANOVA de modelo mixto para evaluar la interacción grupo × tiempo. Dentro de cada grupo, los efectos temporales de la intervención se evaluaron mediante ANOVA de medidas repetidas con la comparación múltiple de Bonferroni. Donde solo había dos conjuntos de datos dentro de cada grupo (es decir, solo los datos de referencia y de intervención como en los datos obtenidos de biopsias de tejido) se usaron pruebas t pareadas para datos distribuidos normalmente y la prueba de Wilcoxon cuando los datos no tenían una distribución normal. El coeficiente de correlación de Pearson se calculó para expresar la relación entre los cambios desde el inicio hasta la intervención para datos normalmente distribuidos y el coeficiente de correlación de Spearman se calculó cuando los datos no tenían una distribución normal. Se utilizó Statistica 9.0, StatSoft, Inc. USA para realizar todos los procedimientos estadísticos.