Effecten van chronische blootstelling via de voeding aan aminozuren met vertakte keten

Onderwerpen en methoden Elders vermeld Interventie Elders vermeld

Klinisch onderzoek Elke proefpersoon onderging een medische basiscontrole met antropometrisch onderzoek (lengte (m), gewicht (kg), BMI (kg/m2), tailleomtrek (cm), taille-heupverhouding). De lichaamssamenstelling werd gemeten met behulp van bio-impedantieanalyse (BIA, Nutriguard-M, Data Input GmbH, Duitsland). Elk van de bovengenoemde metingen werd drie keer uitgevoerd en het gemiddelde werd geregistreerd.

Dieetbeoordeling Elke deelnemer vulde een prospectieve vragenlijst in, waarbij voedingsgegevens van 3 dagen werden verzameld (2 werkdagen, 1 weekenddag). Voor berekeningen van de inname via de voeding werd het Nutridan-programma gebruikt. Aangezien voedingsgegevens van sommige speciale veganistische producten niet beschikbaar zijn in de database, werd veganisten gevraagd om pakketten van deze producten te verzamelen met de door de producent opgegeven voedingswaarde, en deze gegevens werden gebruikt voor berekeningen. Sacchariden, lipiden- en eiwitinname werden afzonderlijk berekend. Het BCAA-gehalte van voedingseiwitten werd geschat met behulp van een voedingsdatabase.

Beoordeling van fysieke activiteit Fysieke activiteit werd in de hele steekproef beoordeeld met behulp van de Baecke-vragenlijst voor gebruikelijke fysieke activiteit [1], die goed correleert met het maximale zuurstofverbruik (VO2max)[2]. Bij elke proefpersoon werd een maximale inspanningstest uitgevoerd op een elektromagnetisch geremde fietsergometer (Ergoline 800, Bitz, Duitsland) om de maximale zuurstofopname (Vo2peak) te bepalen. Een initiële belasting van 50 W werd elke minuut met 25 W verhoogd tot vermoeidheid ondanks de verbale aanmoediging. De zuurstofopname werd gemeten met behulp van Vmax, Sensor Medics (Yorba Linda, CA). De hartslag werd continu gecontroleerd.

Laboratoriumanalyse Na 12 uur vasten werd bij elke proefpersoon perifeer veneus bloed afgenomen. Parameters van glucosehomeostase werden beoordeeld in gecertificeerd academisch ziekenhuislaboratorium: plasmaglucose met behulp van hexokinasereactie (kit KONELAB, Duitsland), HbA1c met behulp van hogedrukvloeistofboronaat-affiniteitschromatografie (Primus Corporation), insuline met behulp van vaste-fase competitieve chemiluminescente enzymimmunoassay (Immulite 2000) . Lipidenprofiel: totaal cholesterol en triglyceriden werden gemeten met behulp van de enzymatische methode (kit KONELAB, Duitsland), HDL-cholesterol met behulp van PEG-gemodificeerde enzymatische meting (kit ROCHE, Zwitserland). Plasmaniveaus van vrije vetzuren (FFA) werden gemeten met behulp van de reeds beschreven methode [12]. Kort gezegd werden FFA's samen met neutrale lipiden geëxtraheerd met behulp van isooctaan en gereinigd door middel van omgekeerde extractie. Op deze manier verkregen FA werden gederivatiseerd tot methylesters en vervolgens geanalyseerd met behulp van gaschromatografie (GC). Serum AA-niveaus werden bepaald met behulp van capillaire elektroforese (CE) met contactloze geleidbaarheidsdetectie, die al in detail is beschreven [3, 4]. CE-metingen werden uitgevoerd met behulp van het HP3DCE-systeem (Agilent Technologies, Waldbronn, Duitsland) uitgerust met een ingebouwde contactloze geleidbaarheidsdetector.

Insulinegevoeligheid en IS-secretie werden beoordeeld met behulp van een 2 uur durende hyperinsulinemische euglycemische klem, elders beschreven methode[5]. Klem werd uitgevoerd na 12 uur vasten in een standaard insulinedosis van 1 mIU/kg/min en er werd een infuus van 15% glucose-oplossing gebruikt. Voor de metingen werd de gemiddelde infusiesnelheid in stabiele toestand van de klem (6 opeenvolgende metingen) gebruikt. Glucoseverwijdering werd uitgedrukt als metabole klaringssnelheid (MCR, ml.kg-1.min-1) na correctie voor veranderingen in glucosepool in extracellulaire vloeistof (ruimtecorrectie) en insulinegevoeligheidsindex (MCR gedeeld door stady state insulinemie, MCR/I, ml.kg-1.min-1/mU.l-1). De insulinesecretie werd beoordeeld door middel van een intraveneuze argininetest, zoals reeds beschreven [6], uitgevoerd op een andere dag (ongeveer 7 dagen ertussen) vanaf de glucoseklem. Acute insulinerespons werd berekend als het incrementele trapeziumvormige gebied voor insuline gedurende de 30 minuten van de test.

Spierbiopsie, ademhalingsketen en citraatsynthase-enzymactiviteiten Bij elke deelnemer werd een skeletspiermonster van de vastus lateralis-spier uitgevoerd met behulp van een standaard Bergström-techniek [7, 8]. Biopsie werd uitgevoerd onder nuchtere omstandigheden. Ongeveer 200 mg nat gewicht werd verkregen. Het monster werd onmiddellijk aan microdissectie onderworpen, gewogen, verdeeld voor respectievelijke analyses en snel ingevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij -80oC tot analyse.

De enzymatische activiteit van de mitochondriale ademhalingsketen (RC) en de activiteit van citraatsynthase (CS) werden spectrofotometrisch gemeten in spierhomogenaten. Spierhomogenaten werden bereid zoals beschreven [9]. In het kort werd ongeveer 50 mg SM in kleine fragmenten gesneden en gehomogeniseerd (glas-glasmolen) in 20 volumes ijskoude homogenisatiebuffer (250 mM sucrose, 20 mM Tris, 40 mM KCl, 2 mM EGTA, proteaseremmercocktail, pH 7,4). De homogenaten werden vervolgens gedurende 1 minuut bij 600 g bij 4°C gecentrifugeerd en de supernatanten werden onmiddellijk voor analyse gebruikt. Eiwitconcentratie werd gemeten in aliquots met behulp van de bicinchoninezuur (BCA) assay (Sigma). Activiteit van complexe I-IV en CS werd bepaald overeenkomstig eerder gepubliceerde protocollen [10-11], die werden aangepast voor meting in een microplaatlezer (Infinite M200 PRO, Tecan). Alle metingen werden uitgevoerd in tetraplicaten. Activiteiten van RC en CS werden uitgedrukt als nmol/min/mg totale eiwitten, behalve complex IV, dat werd uitgedrukt als A log (A550)/min/mg totale eiwitten. De enzymatische activiteiten van de RC-complexen werden ook genormaliseerd naar de activiteit van CS, dat wordt gebruikt als een marker voor de overvloed aan mitochondriën in een weefsel.

Vetweefselbiopsie Bij elke deelnemer werd een subcutane abdominale vetweefselbiopsie (SAAT) uitgevoerd. Bergström-naald werd gebruikt om monsters van onderhuids vet uit het paraumbilicale gebied te verkrijgen, zoals reeds beschreven [12]. Biopsie werd uitgevoerd onder nuchtere omstandigheden. Ongeveer 300 mg nat gewicht werd verkregen. Het monster werd onmiddellijk aan microdissectie onderworpen, gewogen, verdeeld voor respectievelijke analyses en snel ingevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij -80oC tot analyse.

Kwantitatieve real-time PCR (RT-qPCR) Totaal RNA uit weefsels werd geïsoleerd met behulp van Lipid Tissue en Fibrous Tissue RNeasy Mini Kits (Qiagen). De RNA-concentratie werd gemeten met Nanodrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, VS). RNA werd behandeld met DNAse I (Invitrogen, Carlsbad CA, VS) om eventueel verontreinigend genomisch DNA te verwijderen. cDNA werd bereid uit 200-600 ng RNA met behulp van een cDNA-archiefkit met hoge capaciteit (Applied Biosystems, Carlsbad CA, VS). Equivalent van 5 ng RNA werd gebruikt voor real-time PCR-reacties met behulp van Fast Advanced master mix en Gene expression assay (IRS1, GLUT4, BCKDHA, BCKDHB, ACOX, CPT1b, PLIN1, PLIN2, PLIN5, FASN, SCD1, DGAT2, PPAR-γ ; Toegepaste biosystemen). Alle monsters werden in duplo uitgevoerd. Genexpressie van doelwitgenen werd genormaliseerd naar expressie van RPS13 (glucuronidase, bèta) en de vouwverandering van expressie werd berekend met behulp van de delta delta Ct-methode.

Vetzuurspectrum in AT Het vetzuurspectrum in AT werd beoordeeld met behulp van gaschromatografie, een methode die al is beschreven door Lepage en Roy [13] met modificaties door Rodriguez-Palmero et al. [14] Kort gezegd omvat de methode een chloroform/methanol-extractie van gevriesdroogd AT om lipiden te isoleren en daaropvolgende omestering of verestering van FA gebonden aan lipiden om methylesters te vormen, die vervolgens werden geanalyseerd met behulp van gaschromatografie.

Statistische analyse Gegevens worden gepresenteerd in tekst, tabellen en figuren als gemiddelden ± SD met 95% BI en p-waarden <0,05 werden als statistisch significant beschouwd. Student t-test werd gebruikt in observatiemonsters voor normaal verdeelde gegevens. Wilcoxon matched pairs-test werd gebruikt wanneer gegevens niet normaal verdeeld waren. Interventiemonsters werden vergeleken met behulp van een algemeen lineair model om de statistische significantie van verschillen tussen groepen te testen. Een ANOVA met gemengd model werd gebruikt om de interactie tussen groep x tijd te beoordelen. Binnen elke groep werden de tijdseffecten van de interventie beoordeeld met behulp van ANOVA met herhaalde metingen met Bonferroni's meervoudige vergelijking. Waar er slechts twee datasets binnen elke groep waren (d.w.z. alleen basislijn- en interventiegegevens zoals in gegevens verkregen uit weefselbiopten) gepaarde t-toetsen werden gebruikt voor normaal verdeelde gegevens en Wilcoxon-test wanneer gegevens niet normaal verdeeld waren. De correlatiecoëfficiënt van Pearson werd berekend om de relatie uit te drukken tussen veranderingen van baseline tot interventie voor normaal verdeelde gegevens en de correlatiecoëfficiënt van Spearman werd berekend wanneer gegevens niet normaal verdeeld waren. Statistica 9.0, StatSoft, Inc. USA werd gebruikt om alle statistische procedures uit te voeren.