Effekter af kronisk diæteksponering for forgrenede aminosyrer

Emner og metoder Opført andetsteds Intervention Opført andetsteds

Klinisk undersøgelse Hvert forsøgsperson gennemgik et grundlæggende lægetjek med antropometrisk undersøgelse (højde (m), vægt (kg), BMI (kg/m2), taljeomkreds (cm), talje-hofte-forhold). Kropssammensætning blev målt ved hjælp af bioimpedansanalyse (BIA, Nutriguard-M, Data Input GmbH, Tyskland). Hver af de ovennævnte målinger blev udført tre gange, og middelværdien blev registreret.

Kostvurdering Hver deltager udfyldte et prospektivt spørgeskema, hvor kostdata fra 3 dage blev indsamlet (2 hverdage, 1 weekenddag). Til kostindtagsberegninger blev Nutridan-programmet brugt. Da ernæringsdata for nogle særlige veganske produkter ikke er tilgængelige i databasen, blev veganere bedt om at indsamle pakker fra disse produkter med producentdeklareret næringsindhold, og disse data blev brugt til beregninger. Saccharider, lipid- og proteinindtag blev beregnet separat. BCAA indholdet af kostproteiner blev estimeret ved hjælp af ernæringsdatabase.

Vurdering af fysisk aktivitet Fysisk aktivitet blev vurderet i hele prøven ved hjælp af Baecke-spørgeskemaet for sædvanlig fysisk aktivitet [1], som korrelerer godt med maksimalt iltforbrug (VO2max)[2]. Maksimal træningstest blev udført i hvert individ på et elektromagnetisk bremset cykelergometer (Ergoline 800, Bitz, Tyskland) for at bestemme maksimal iltoptagelse (Vo2peak). En indledende arbejdsbelastning på 50 W blev øget med 25 W hvert minut kontinuerligt indtil træthed på trods af den verbale opmuntring. Iltoptagelse blev målt under anvendelse af Vmax, Sensor Medics (Yorba Linda, CA). Hjertefrekvensen blev overvåget kontinuerligt.

Laboratorieanalyse Perifert veneblod blev udtaget fra hvert individ efter 12 timers faste. Parametre for glukosehomeostase blev vurderet i certificeret universitetshospitalslaboratorium: plasmaglukose ved hjælp af hexokinasereaktion (kit KONELAB, Tyskland), HbA1c ved hjælp af højtryks flydende boronat afinit-kromatografi (Primus corporation), insulin ved hjælp af fastfase-konkurrerende kemiluminescerende enzymimmunoassay (Immulite 2000) . Lipidprofil: total kolesterol og triglycerider blev målt ved hjælp af enzymatisk metode (kit KONELAB, Tyskland), HDL-kolesterol ved hjælp af PEG-modificeret enzymatisk måling (kit ROCHE, Schweiz). Plasmaniveauer af frie fedtsyrer (FFA) blev målt ved hjælp af den allerede beskrevne metode [12]. Kort fortalt blev FFA ekstraheret sammen med neutrale lipider under anvendelse af isooctan og renset ved omvendt ekstraktion. FA opnået på denne måde blev derivatiseret til methylestere og efterfølgende analyseret ved anvendelse af gaskromatografi (GC). Serum AA-niveauer blev bestemt ved hjælp af kapillarelektroforese (CE) med kontaktløs ledningsevnedetektion, som allerede er blevet beskrevet i detaljer [3, 4]. CE-målinger blev udført ved hjælp af HP3DCE-systemet (Agilent Technologies, Waldbronn, Tyskland) udstyret med en indbygget kontaktløs ledningsevnedetektor.

Insulinfølsomhed og sekretion IS blev vurderet ved hjælp af 2-timers hyperinsulinæmisk euglykæmisk klemme, metode beskrevet andetsteds[5]. Clamp blev udført efter 12 timers faste i en standard insulindosis på 1 mIU/kg/min og en infusion af 15 % glucoseopløsning blev anvendt. Gennemsnitlig infusionshastighed i steady-state af klemmen (6 på hinanden følgende målinger) blev brugt til målinger. Bortskaffelse af glukose blev udtrykt som metabolisk clearancehastighed (MCR, ml.kg-1.min-1) efter korrektion for ændringer i glukosepool i ekstracellulær væske (rumskorrektion) og insulinfølsomhedsindeks (MCR divideret med stady state insulinæmi, MCR/I, ml.kg-1.min-1/mU.l-1). Insulinsekretion blev vurderet ved IV arginin test som allerede beskrevet [6] udført på en anden dag (ved ca. 7 dage imellem) fra glucoseklemme. Akut insulinrespons blev beregnet som det inkrementelle trapezareal for insulin i løbet af testens 30 minutter.

Muskelbiopsi, respirationskæde og citratsyntase-enzymer aktiviteter Skeletmuskelprøve fra vastus lateralis-muskel blev udført hos hver deltager ved hjælp af en standard Bergström-teknik[7, 8]. Biopsi blev udført ved fastende forhold. Ca. 200 mg vådvægt blev opnået. Prøven blev straks mikrodissekeret, vejet, delt til respektive analyser og lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret i -80oC indtil analyser.

Mitokondriel respiratorisk kæde (RC) enzymatisk aktivitet og citratsyntase (CS) aktivitet blev målt spektrofotometrisk i muskelhomogenater. Muskelhomogenater blev fremstillet som beskrevet [9]. Kort fortalt blev omkring 50 mg SM skåret i små fragmenter og homogeniseret (glas-glaskværn) i 20 volumener iskold homogeniseringsbuffer (250 mM saccharose, 20 mM Tris, 40 mM KCl, 2 mM EGTA, proteaseinhibitorcocktail, pH 7,4). Homogenaterne blev derefter centrifugeret i 1 minut ved 600 g ved 4°C, og supernatanterne blev straks anvendt til analyse. Proteinkoncentrationen blev målt i alikvoter under anvendelse af bicinchoninsyre (BCA) assay (Sigma). Aktiviteten af ​​kompleks I-IV og CS blev bestemt i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte protokoller [10-11], der blev modificeret til måling i en mikropladelæser (Infinite M200 PRO, Tecan). Alle målinger blev foretaget i tetraplikater. Aktiviteter af RC og CS blev udtrykt som nmol/min/mg af totale proteiner, bortset fra kompleks IV, som blev udtrykt som Δ log (A550)/min/mg af totale proteiner. De enzymatiske aktiviteter af RC-komplekserne blev også normaliseret til aktiviteten af ​​CS, som bruges som en markør for mængden af ​​mitokondrier i et væv.

Fedtvævsbiopsi Subkutan abdominal fedtvævsbiopsi (SAAT) blev udført hos hver deltager. Bergström nål blev brugt til at opnå prøver af subkutant fedt fra paraumbilical område som allerede beskrevet [12]. Biopsi blev udført ved fastende forhold. Ca. 300 mg vådvægt blev opnået. Prøven blev straks mikrodissekeret, vejet, delt til respektive analyser og lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret i -80oC indtil analyser.

Kvantitativ realtids-PCR (RT-qPCR) Totalt RNA fra væv blev isoleret ved hjælp af Lipid Tissue og Fibrous Tissue RNeasy Mini Kits (Qiagen). RNA-koncentrationen blev målt ved Nanodrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, USA). RNA blev behandlet med DNAse I (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) for at fjerne eventuel kontaminerende genomisk DNA. cDNA blev fremstillet ud fra 200-600 ng RNA under anvendelse af High Capacity cDNA-arkivkit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Ækvivalent af 5 ng RNA blev brugt til realtids PCR-reaktioner ved brug af Fast Advanced mastermix og genekspressionsassay (IRS1, GLUT4, BCKDHA, BCKDHB, ACOX, CPT1b, PLIN1, PLIN2, PLIN5, FASN, SCD1, DGAT2, PPAR-γ ; Applied Biosystems). Alle prøver blev kørt i duplikater. Genekspression af målgener blev normaliseret til ekspression af RPS13 (glucuronidase, beta), og foldændring af ekspression blev beregnet ved hjælp af delta delta Ct-metoden.

Fedtsyrespektrum i AT Fedtsyrespektrum i AT blev vurderet ved hjælp af gaskromatografi, en metode, der allerede er beskrevet af Lepage og Roy [13] med modifikationer af Rodriguez-Palmero et al. [14] Kort fortalt involverer metoden en chloroform/methanol-ekstraktion af frysetørret AT for at isolere lipider og efterfølgende transesterificering eller esterificering af FA bundet til lipider for at danne methylestere, som derefter blev analyseret ved hjælp af gaskromatografi.

Statistisk analyse Data præsenteres i tekst, tabeller og figurer som middelværdier ± SD med 95 % CI og p-værdier <0,05 blev betragtet som statistisk signifikante. Student t-test blev brugt i observationsprøver for normalfordelte data. Wilcoxon matchede par test blev brugt, når data ikke var normalfordelt. Interventionsprøver blev sammenlignet ved hjælp af en generel lineær model for at teste den statistiske signifikans af forskelle mellem grupper. En blandet model ANOVA blev brugt til at vurdere gruppe × tidsinteraktion. Inden for hver gruppe blev tidseffekterne af interventionen vurderet ved hjælp af gentagne målinger ANOVA med Bonferronis multiple sammenligning. Hvor der kun var to datasæt inden for hver gruppe (dvs. kun baseline- og interventionsdata som i data opnået fra vævsbiopsier) parrede t-test blev brugt til normalfordelte data og Wilcoxon-test, når data ikke var normalfordelt. Pearsons korrelationskoefficient blev beregnet til at udtrykke forholdet mellem ændringer fra baseline til intervention for normalfordelte data, og Spearmans korrelationskoefficient blev beregnet, når data ikke var normalfordelt. Statistica 9.0, StatSoft, Inc. USA blev brugt til at udføre alle statistiske procedurer.