분지 사슬 아미노산에 대한 만성 식이 노출의 영향

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임상검사 각 피험자는 인체측정학적 검사(신장(m), 체중(kg), BMI(kg/m2), 허리둘레(cm), 허리-엉덩이 비율)와 함께 기본적인 건강검진을 받았다. 생체 임피던스 분석법(BIA, Nutriguard-M, Data Input GmbH, Germany)을 이용하여 체성분을 측정하였다. 위에서 언급한 각 측정은 세 번 수행되었으며 평균이 기록되었습니다.

식이 평가 각 참가자는 3일(근무일 2일, 주말 1일)의 식이 데이터를 수집한 전향적 설문지를 작성했습니다. 식이 섭취량 계산을 위해 Nutridan 프로그램이 사용되었습니다. 일부 특수 비건 제품의 영양 데이터는 데이터베이스에서 사용할 수 없기 때문에 완전 채식주의자는 이러한 제품에서 생산자가 영양 성분을 선언한 패키지를 수집하도록 요청했으며 이 데이터를 계산에 사용했습니다. 당류, 지질 및 단백질 섭취량은 별도로 계산되었습니다. 식이 단백질의 BCAA 함량은 영양 데이터베이스를 사용하여 추정되었습니다.

신체 활동 평가 신체 활동은 최대 산소 소비량(VO2max)[2]과 밀접한 관련이 있는 습관적인 신체 활동[1]에 대한 Baecke 설문지를 사용하여 전체 표본에서 평가되었습니다. 최고산소섭취량(Vo2peak)을 측정하기 위해 전자기 제동 자전거 에르고미터(Ergoline 800, Bitz, Germany)에서 각 피험자에 대해 최대 운동 테스트를 수행했습니다. 초기 작업부하 50W는 말의 격려에도 불구하고 지칠 때까지 분당 25W씩 지속적으로 증가시켰다. Vmax, Sensor Medics(Yorba Linda, CA)를 사용하여 산소 섭취량을 측정했습니다. 심박수를 지속적으로 모니터링했습니다.

실험실 분석 말초 정맥혈은 12시간 금식 후 각 피험자로부터 채취되었습니다. 포도당 항상성의 매개변수는 인증된 대학 병원 실험실에서 평가되었습니다: hexokinase 반응을 사용한 혈장 포도당(kit KONELAB, 독일), 고압 액체 보로네이트 아피니트 크로마토그래피(Primus Corporation)를 사용한 HbA1c, 고체상 경쟁적 화학발광 효소 면역분석(Immulite 2000)을 사용한 인슐린 . 지질 프로파일: 총 콜레스테롤 및 트리글리세라이드는 효소 방법(kit KONELAB, 독일)을 사용하여 측정하였고, HDL-콜레스테롤은 PEG 변형 효소 측정(kit ROCHE, 스위스)을 사용하여 측정하였다. 유리 지방산(FFA)의 혈장 수치는 이미 설명한 방법을 사용하여 측정했습니다[12]. 간략하게, FFA는 이소옥탄을 사용하여 중성 지질과 함께 추출되고 역추출에 의해 세척된다. 이러한 방식으로 얻은 FA는 메틸에스테르로 유도체화되었고 이후 가스 크로마토그래피(GC)를 사용하여 분석되었습니다. 혈청 AA 수치는 비접촉식 전도도 검출과 함께 모세관 전기영동(CE)을 사용하여 결정되었으며, 이는 이미 자세히 설명되어 있습니다[3, 4]. 비접촉식 전도도 검출기가 내장된 HP3DCE 시스템(Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)을 사용하여 CE 측정을 수행했습니다.

인슐린 감수성과 분비 IS는 다른 곳에서 기술된 방법인 2시간 고인슐린혈증 정상혈당 클램프를 사용하여 평가되었습니다[5]. 클램프는 표준 인슐린 용량 1mIU/kg/min에서 12시간 금식 후 수행되었으며 15% 포도당 용액 주입이 사용되었습니다. 클램프의 정상 상태(6회 연속 측정)의 평균 주입 속도를 측정에 사용했습니다. 포도당 처리량은 대사 제거율(MCR, ml.kg-1.min-1)로 표현되었습니다. 세포외액의 포도당 풀 변화(공간 보정) 및 인슐린 감수성 지수(MCR을 정상 상태 인슐린혈증으로 나눈 값, MCR/I, ml.kg-1.min-1/mU.l-1)에 대한 보정 후. 인슐린 분비는 포도당 클램프와 다른 날(약 7일 사이)에 수행된 [6]에 이미 기술된 바와 같이 IV 아르기닌 테스트에 의해 평가되었습니다. 급성 인슐린 반응은 시험 30분 동안 인슐린에 대한 증분 사다리꼴 영역으로 계산되었습니다.

근육 생검, 호흡 연쇄 및 구연산 합성효소 활동 외측광근의 골격근 샘플은 표준 Bergström 기술[7, 8]을 사용하여 모든 참가자에서 수행되었습니다. 생검은 금식 상태에서 수행되었습니다. 약 200mg의 습윤 중량을 얻었다. 시료는 즉시 현미해부하고, 무게를 재고, 각각의 분석을 위해 나누었고, 액체 질소에서 급속 냉동하여 분석할 때까지 -80oC에 보관했습니다.

미토콘드리아 호흡 사슬(RC) 효소 활성 및 구연산 합성효소(CS) 활성을 근육 균질물에서 분광광도계로 측정했습니다. 근육 균질물은 [9]에 설명된 대로 준비되었습니다. 간략하게, 약 50mg의 SM을 작은 조각으로 절단하고 20부피의 얼음처럼 차가운 균질화 완충액(250mM 수크로스, 20mM 트리스, 40mM KCl, 2mM EGTA, 프로테아제 억제제 칵테일, 산도 7.4). 그런 다음 균질액을 4°C에서 600g에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 즉시 분석에 사용했습니다. BCA(bicinchoninic acid) 분석법(Sigma)을 사용하여 단백질 농도를 분취량으로 측정했습니다. 복합체 I-IV 및 CS의 활동은 마이크로플레이트 판독기(Infinite M200 PRO, Tecan)에서 측정하기 위해 수정된 이전에 발표된 프로토콜[10-11]에 따라 결정되었습니다. 모든 측정은 tetraplicates에서 이루어졌습니다. RC 및 CS의 활성은 Δ log(A550)/min/mg of total protein으로 표현되는 complex IV를 제외하고 nmol/min/mg of total protein으로 표현하였다. RC 복합체의 효소 활성은 또한 조직 내 풍부한 미토콘드리아의 마커로 사용되는 CS의 활성으로 정규화되었습니다.

지방 조직 생검 피하 복부 지방 조직(SAAT) 생검을 모든 참가자에게 시행했습니다. 이미 설명한 바와 같이 Bergström 바늘을 사용하여 제대주변 부위에서 피하 지방 샘플을 채취했습니다[12]. 생검은 금식 상태에서 수행되었습니다. 약 300mg의 습윤 중량을 얻었다. 시료는 즉시 현미해부하고, 무게를 재고, 각각의 분석을 위해 나누었고, 액체 질소에서 급속 냉동하여 분석할 때까지 -80oC에 보관했습니다.

정량적 실시간 PCR(RT-qPCR) 지질 조직 및 섬유 조직 RNeasy Mini Kits(Qiagen)를 사용하여 조직의 총 RNA를 분리했습니다. RNA 농도는 Nanodrop1000(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, USA)으로 측정했습니다. RNA를 DNAse I(Invitrogen, Carlsbad CA, USA)로 처리하여 오염된 게놈 DNA를 제거했습니다. 고용량 cDNA 아카이브 키트(Applied Biosystems, Carlsbad CA, USA)를 사용하여 200-600 ng의 RNA로부터 cDNA를 준비했습니다. Fast Advanced master mix 및 Gene expression assay(IRS1, GLUT4, BCKDHA, BCKDHB, ACOX, CPT1b, PLIN1, PLIN2, PLIN5, FASN, SCD1, DGAT2, PPAR-γ)를 사용하여 Real Time PCR 반응에 5ng 상당의 RNA를 사용했습니다. ; 응용 바이오시스템즈). 모든 샘플은 중복으로 실행되었습니다. 표적 유전자의 유전자 발현을 RPS13(글루쿠로니다제, 베타)의 발현으로 정규화하고 델타 델타 Ct 방법을 사용하여 발현의 배수 변화를 계산하였다.

AT의 지방산 스펙트럼 AT의 지방산 스펙트럼은 Lepage와 Roy[13]가 이미 설명한 방법과 Rodriguez-Palmero 등이 수정한 가스 크로마토그래피를 사용하여 평가했습니다. 간단히 말해서, 이 방법은 지질을 분리하기 위해 동결 건조된 AT의 클로로포름/메탄올 추출과 지질에 결합된 FA의 에스테르교환 또는 에스테르화를 포함하여 메틸 에스테르를 형성한 다음 가스 크로마토그래피를 사용하여 분석되었습니다.

통계 분석 데이터는 95% CI 및 p-값 <0.05가 통계적으로 유의한 것으로 간주되는 평균 ± SD로 텍스트, 표 및 그림으로 표시됩니다. 스튜던트 t-테스트는 정규 분포 데이터에 대한 관찰 샘플에 사용되었습니다. 데이터가 정상적으로 분포되지 않은 경우 Wilcoxon Matched Pairs 테스트를 사용했습니다. 개입 샘플은 그룹 간 차이의 통계적 유의성을 테스트하기 위해 일반 선형 모델을 사용하여 비교되었습니다. 그룹 × 시간 상호 작용을 평가하기 위해 혼합 모델 ANOVA를 사용했습니다. 각 그룹 내에서 개입의 시간 효과는 Bonferroni의 다중 비교와 함께 반복 측정 ANOVA를 사용하여 평가되었습니다. 각 그룹 내에 두 개의 데이터 세트만 있는 경우(즉, 조직 생검에서 얻은 데이터에서와 같이 기준선 및 개입 데이터만) 정규 분포 데이터에는 쌍을 이룬 t-검정을 사용하고 데이터가 정규 분포를 따르지 않는 경우 Wilcoxon 검정을 사용했습니다. Pearson 상관계수는 데이터가 정규분포된 경우 기준선에서 개입까지의 변화 사이의 관계를 나타내기 위해 계산되었으며 Spearman 상관계수는 데이터가 정규분포되지 않은 경우 계산되었습니다. Statistica 9.0, StatSoft, Inc. USA를 사용하여 모든 통계 절차를 수행했습니다.