Effekter av kronisk dietteksponering for forgrenede aminosyrer

Emner og metoder Oppført andre steder Intervensjon Oppført andre steder

Klinisk undersøkelse Hvert forsøksperson gjennomgikk en grunnleggende legesjekk med antropometrisk undersøkelse (høyde (m), vekt (kg), BMI (kg/m2), midjeomkrets (cm), midje-hofteforhold). Kroppssammensetning ble målt ved bruk av bioimpedansanalyse (BIA, Nutriguard-M, Data Input GmbH, Tyskland). Hver av de ovennevnte målingene ble utført tre ganger og gjennomsnitt ble registrert.

Kostholdsvurdering Hver deltaker fylte ut et prospektivt spørreskjema, hvor kostholdsdata fra 3 dager ble samlet inn (2 virkedager, 1 helgedag). For kostinntaksberegninger ble Nutridan-programmet brukt. Siden ernæringsdata for noen spesielle veganske produkter ikke er tilgjengelig i databasen, ble veganere bedt om å samle inn pakker fra disse produktene med produsentdeklarert næringsinnhold, og disse dataene ble brukt til beregninger. Sakkarider, lipid og proteininntak ble beregnet separat. BCAA-innholdet i diettproteiner ble estimert ved hjelp av ernæringsdatabase.

Fysisk aktivitetsvurdering Fysisk aktivitet ble vurdert i hele utvalget ved å bruke Baecke spørreskjema for vanlig fysisk aktivitet [1], som korrelerer godt med maksimalt oksygenforbruk (VO2max)[2]. Maksimal treningstest ble utført i hvert forsøksperson på et elektromagnetisk bremset sykkelergometer (Ergoline 800, Bitz, Tyskland) for å bestemme maksimalt oksygenopptak (Vo2peak). En første arbeidsbelastning på 50 W ble økt med 25 W hvert minutt kontinuerlig inntil utmattelse til tross for den verbale oppmuntringen. Oksygenopptak ble målt ved bruk av Vmax, Sensor Medics (Yorba Linda, CA). Hjertefrekvensen ble overvåket kontinuerlig.

Laboratorieanalyse Perifert veneblod ble trukket fra hvert individ etter 12 timers faste. Parametre for glukosehomeostase ble vurdert i et sertifisert universitetssykehuslaboratorium: plasmaglukose ved bruk av heksokinasereaksjon (sett KONELAB, Tyskland), HbA1c ved bruk av høytrykks væskeboronat afinit-kromatografi (Primus corporation), insulin ved bruk av solidfase konkurrerende kjemiluminescerende enzymimmunoassay (Immulite 2000) . Lipidprofil: totalkolesterol og triglyserider ble målt ved bruk av enzymatisk metode (sett KONELAB, Tyskland), HDL-kolesterol ved bruk av PEG-modifisert enzymatisk måling (sett ROCHE, Sveits). Plasmanivåer av frie fettsyrer (FFA) ble målt ved bruk av metode som allerede er beskrevet [12]. Kort fortalt ble FFA ekstrahert sammen med nøytrale lipider ved bruk av isooktan og renset ved omvendt ekstraksjon. FA oppnådd på denne måten ble derivatisert til metylestere og deretter analysert ved bruk av gasskromatografi (GC). Serum AA-nivåer ble bestemt ved bruk av kapillærelektroforese (CE) med kontaktløs konduktivitetsdeteksjon, som allerede er beskrevet i detaljer [3, 4]. CE-målinger ble utført ved hjelp av HP3DCE-systemet (Agilent Technologies, Waldbronn, Tyskland) utstyrt med en innebygd kontaktløs konduktivitetsdetektor.

Insulinfølsomhet og sekresjon IS ble vurdert ved bruk av 2-timers hyperinsulinaemisk euglykemisk klemme, metode beskrevet annet sted[5]. Klemme ble utført etter 12 timers faste i en standard insulindose 1mIU/kg/min og en infusjon av 15 % glukoseløsning ble brukt. Gjennomsnittlig infusjonshastighet i steady-state av klemmen (6 påfølgende målinger) ble brukt for målinger. Avhending av glukose ble uttrykt som metabolsk clearance rate (MCR, ml.kg-1.min-1) etter korreksjon for endringer i glukosepool i ekstracellulær væske (space correction) og insulinsensitivitetsindeks (MCR dividert med stady state insulinemi, MCR/I, ml.kg-1.min-1/mU.l-1). Insulinsekresjon ble vurdert ved IV arginintest som allerede beskrevet [6] utført på en annen dag (ved ca. 7 dager i mellom) fra glukoseklemme. Akutt insulinrespons ble beregnet som det inkrementelle trapesarealet for insulin i løpet av testens 30 minutter.

Muskelbiopsi, respirasjonskjede og citratsyntase-enzymer aktiviteter Skjelettmuskelprøve fra vastus lateralis-muskel ble utført hos hver deltaker ved bruk av en standard Bergström-teknikk[7, 8]. Biopsi ble utført ved fastende forhold. Ca. 200 mg våtvekt ble oppnådd. Prøven ble umiddelbart mikrodissekert, veid, delt for respektive analyser og hurtigfryst i flytende nitrogen og lagret i -80oC frem til analyser.

Mitokondriell respiratorisk kjede (RC) enzymatisk aktivitet og sitratsyntase (CS) aktivitet ble målt spektrofotometrisk i muskelhomogenater. Muskelhomogenater ble fremstilt som beskrevet [9]. Kort fortalt ble omtrent 50 mg SM kuttet i små fragmenter og homogenisert (glass-glasskvern) i 20 volumer iskald homogeniseringsbuffer (250 mM sukrose, 20 mM Tris, 40 mM KCl, 2 mM EGTA, proteaseinhibitorcocktail, pH 7,4). Homogenatene ble deretter sentrifugert i 1 min ved 600 g ved 4°C og supernatantene ble umiddelbart brukt for analyse. Proteinkonsentrasjonen ble målt i alikvoter ved å bruke bicinchoninsyre (BCA) analysen (Sigma). Aktiviteten til kompleks I-IV og CS ble bestemt i henhold til tidligere publiserte protokoller [10-11], som ble modifisert for måling i en mikroplateleser (Infinite M200 PRO, Tecan). Alle målinger ble gjort i tetraplikater. Aktiviteter av RC og CS ble uttrykt som nmol/min/mg av totale proteiner, bortsett fra kompleks IV, som ble uttrykt som Δ log (A550)/min/mg av totale proteiner. De enzymatiske aktivitetene til RC-kompleksene ble også normalisert til aktiviteten til CS, som brukes som en markør for overflod av mitokondrier i et vev.

Fettvevsbiopsi Subkutan abdominal fettvev (SAAT) biopsi ble utført hos hver deltaker. Bergström nål ble brukt for å få prøver av subkutant fett fra paraumbilical området som allerede beskrevet [12]. Biopsi ble utført ved fastende forhold. Ca. 300 mg våtvekt ble oppnådd. Prøven ble umiddelbart mikrodissekert, veid, delt for respektive analyser og hurtigfryst i flytende nitrogen og lagret i -80oC frem til analyser.

Kvantitativ sanntids-PCR (RT-qPCR) Totalt RNA fra vev ble isolert ved å bruke Lipid Tissue og Fibrous Tissue RNeasy Mini Kits (Qiagen). RNA-konsentrasjonen ble målt med Nanodrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, USA). RNA ble behandlet med DNAse I (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) for å fjerne kontaminerende genomisk DNA. cDNA ble fremstilt fra 200-600 ng RNA ved bruk av High Capacity cDNA-arkivsett (Applied Biosystems, Carlsbad CA, USA). Ekvivalent av 5 ng RNA ble brukt for sanntids PCR-reaksjoner ved bruk av Fast Advanced mastermix og genekspresjonsanalyse (IRS1, GLUT4, BCKDHA, BCKDHB, ACOX, CPT1b, PLIN1, PLIN2, PLIN5, FASN, SCD1, DGAT2, PPAR-γ ; Applied Biosystems). Alle prøver ble kjørt i duplikater. Genekspresjon av målgener ble normalisert til ekspresjon av RPS13 (glukuronidase, beta) og fold endring av uttrykk ble beregnet ved bruk av delta delta Ct-metoden.

Fettsyrespektrum i AT Fettsyrespektrum i AT ble vurdert ved bruk av gasskromatografi, en metode som allerede er beskrevet av Lepage og Roy [13] med modifikasjoner av Rodriguez-Palmero et al. [14] Kort fortalt involverer metoden en kloroform/metanolekstraksjon av frysetørket AT for å isolere lipider og påfølgende transesterifisering eller forestring av FA bundet til lipider for å danne metylestere, som deretter ble analysert ved hjelp av gasskromatografi.

Statistisk analyse Data presenteres i tekst, tabeller og figurer som gjennomsnitt ± SD med 95 % KI og p-verdier <0,05 ble ansett som statistisk signifikante. Student t-test ble brukt i observasjonsprøver for normalfordelte data. Wilcoxon matchede par-test ble brukt når data ikke var normalfordelt. Intervensjonsprøver ble sammenlignet med en generell lineær modell for å teste den statistiske signifikansen av forskjeller mellom grupper. En blandet modell ANOVA ble brukt for å vurdere gruppe × tidsinteraksjon. Innenfor hver gruppe ble tidseffekter av intervensjonen vurdert ved å bruke gjentatte målinger ANOVA med Bonferronis multiple sammenligning. Der det bare var to datasett innenfor hver gruppe (dvs. bare baseline- og intervensjonsdata som i data hentet fra vevsbiopsier) parede t-tester ble brukt for normalfordelte data og Wilcoxon-testen når data ikke var normalfordelt. Pearsons korrelasjonskoeffisient ble beregnet for å uttrykke forholdet mellom endringer fra baseline til intervensjon for normalfordelte data, og Spearmans korrelasjonskoeffisient ble beregnet når data ikke var normalfordelt. Statistica 9.0, StatSoft, Inc. USA ble brukt til å utføre alle statistiske prosedyrer.