Skutki przewlekłego narażenia dietetycznego na aminokwasy rozgałęzione

Przedmioty i metody Wymienione gdzie indziej Interwencja Wymienione gdzie indziej

Badanie kliniczne U każdego badanego wykonano podstawowe badanie lekarskie z badaniem antropometrycznym (wzrost (m), masa ciała (kg), BMI (kg/m2), obwód talii (cm), stosunek talii do bioder). Skład ciała mierzono za pomocą analizy bioimpedancji (BIA, Nutriguard-M, Data Input GmbH, Niemcy). Każdy z wyżej wymienionych pomiarów wykonano trzykrotnie i zanotowano średnią.

Ocena diety Każdy uczestnik wypełniał ankietę prospektywną, w której zbierano dane żywieniowe z 3 dni (2 dni robocze, 1 dzień weekendowy). Do obliczeń spożycia wykorzystano program Nutridan. Ponieważ dane żywieniowe niektórych specjalnych produktów wegańskich nie są dostępne w bazie danych, poproszono wegan o zebranie opakowań tych produktów z deklarowaną przez producenta wartością odżywczą i te dane posłużyły do ​​obliczeń. Oddzielnie obliczono spożycie sacharydów, lipidów i białek. Zawartość BCAA w białkach dietetycznych oszacowano za pomocą bazy żywieniowej.

Ocena aktywności fizycznej Aktywność fizyczną oceniano w całej badanej grupie za pomocą kwestionariusza Baecke'a dla zwykłej aktywności fizycznej [1], który dobrze koreluje z maksymalnym zużyciem tlenu (VO2max) [2]. U każdego badanego przeprowadzono maksymalny test wysiłkowy na ergometrze rowerowym z hamulcem elektromagnetycznym (Ergoline 800, Bitz, Niemcy) w celu określenia szczytowego poboru tlenu (Vo2peak). Początkowe obciążenie pracą wynoszące 50 W było zwiększane o 25 W co minutę, aż do zmęczenia pomimo werbalnej zachęty. Pobór tlenu mierzono za pomocą Vmax, Sensor Medics (Yorba Linda, CA). Tętno było monitorowane w sposób ciągły.

Analiza laboratoryjna Krew z żył obwodowych pobrano od każdego pacjenta po 12 godzinach postu. Parametry homeostazy glukozy oceniono w certyfikowanym laboratorium Szpitala Uniwersyteckiego: glikemia w osoczu metodą reakcji heksokinazy (zestaw KONELAB, Niemcy), HbA1c metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej boronianowo-afinicznej (Primus Corporation), insulina metodą kompetycyjnego testu immunoenzymatycznego chemiluminescencji w fazie stałej (Immulite 2000). . Profil lipidowy: cholesterol całkowity i triglicerydy mierzono metodą enzymatyczną (zestaw KONELAB, Niemcy), cholesterol HDL metodą enzymatyczną z wykorzystaniem PEG (zestaw ROCHE, Szwajcaria). Poziomy wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) w osoczu mierzono metodą już opisaną [12]. W skrócie, FFA ekstrahowano razem z obojętnymi lipidami przy użyciu izooktanu i oczyszczono metodą odwróconej ekstrakcji. Otrzymane w ten sposób FA derywatyzowano do estrów metylowych, a następnie analizowano metodą chromatografii gazowej (GC). Stężenia AA w surowicy oznaczano za pomocą elektroforezy kapilarnej (CE) z bezkontaktową detekcją przewodnictwa, co zostało już szczegółowo opisane [3, 4]. Pomiary CE przeprowadzono za pomocą systemu HP3DCE (Agilent Technologies, Waldbronn, Niemcy) wyposażonego we wbudowany bezdotykowy detektor przewodności.

Wrażliwość na insulinę i wydzielanie IS oceniano za pomocą 2-godzinnej hiperinsulinemicznej klamry euglikemicznej, metody opisanej w innym miejscu [5]. Klamtę wykonywano po 12-godzinnej głodówce w standardowej dawce insuliny 1mIU/kg/min i stosowano wlew 15% roztworu glukozy. Do pomiarów wykorzystano średnią szybkość infuzji w stanie ustalonym zacisku (6 kolejnych pomiarów). Usuwanie glukozy wyrażono jako wskaźnik klirensu metabolicznego (MCR, ml.kg-1.min-1) po uwzględnieniu zmian puli glukozy w płynie zewnątrzkomórkowym (korekcja przestrzenna) i wskaźnika wrażliwości na insulinę (MCR podzielone przez insulinemię w stanie spoczynku, MCR/I, ml.kg-1.min-1/mU.l-1). Wydzielanie insuliny oceniano za pomocą dożylnego testu z argininą, jak już opisano [6], wykonanego innego dnia (w odstępie około 7 dni) od klamry glukozowej. Ostra odpowiedź insulinowa została obliczona jako przyrostowa powierzchnia trapezu dla insuliny w ciągu 30 minut testu.

Biopsja mięśnia, łańcuch oddechowy i aktywność enzymów syntazy cytrynianowej Próbkę mięśnia szkieletowego z mięśnia obszernego bocznego wykonano u każdego uczestnika, stosując standardową technikę Bergströma [7, 8]. Biopsję wykonano na czczo. Otrzymano około 200 mg mokrej masy. Próbkę natychmiast poddano mikrodysekcji, zważono, podzielono do odpowiednich analiz i szybko zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w -80oC do czasu analiz.

Aktywność enzymatyczną mitochondrialnego łańcucha oddechowego (RC) i aktywność syntazy cytrynianowej (CS) mierzono spektrofotometrycznie w homogenatach mięśniowych. Homogenaty mięśni przygotowano zgodnie z opisem [9]. W skrócie, około 50 mg SM pocięto na małe fragmenty i homogenizowano (młynek szkło-szkło) w 20 objętościach lodowatego buforu do homogenizacji (250 mM sacharoza, 20 mM Tris, 40 mM KCl, 2 mM EGTA, koktajl inhibitorów proteazy, pH 7,4). Homogenaty następnie odwirowywano przez 1 minutę przy 600 gw 4°C i supernatanty natychmiast stosowano do analizy. Stężenie białka mierzono w porcjach stosując test kwasu bicynchoniowego (BCA) (Sigma). Aktywność kompleksu I-IV i CS określono zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami [10-11], które zostały zmodyfikowane do pomiaru w czytniku mikropłytek (Infinite M200 PRO, Tecan). Wszystkie pomiary wykonano w tetraplikacjach. Aktywności RC i CS wyrażono jako nmol/min/mg białek ogółem, z wyjątkiem kompleksu IV, który wyrażono jako log Δ (A550)/min/mg białek ogółem. Aktywności enzymatyczne kompleksów RC znormalizowano również do aktywności CS, która jest wykorzystywana jako marker obfitości mitochondriów w tkance.

Biopsja tkanki tłuszczowej U każdego uczestnika wykonano biopsję podskórnej tkanki tłuszczowej brzucha (SAAT). Igła Bergströma została wykorzystana do pobrania próbek tłuszczu podskórnego z okolic pępka, jak już opisano [12]. Biopsję wykonano na czczo. Otrzymano około 300 mg mokrej masy. Próbkę natychmiast poddano mikrodysekcji, zważono, podzielono do odpowiednich analiz i szybko zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w -80oC do czasu analiz.

Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) Całkowity RNA z tkanek wyizolowano przy użyciu zestawów Lipid Tissue i Fibrous Tissue RNeasy Mini Kit (Qiagen). Stężenie RNA mierzono za pomocą Nanodrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, USA). RNA traktowano DNAzą I (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) w celu usunięcia jakiegokolwiek zanieczyszczającego genomowego DNA. cDNA przygotowano z 200-600 ng RNA przy użyciu zestawu do archiwizacji cDNA o dużej pojemności (Applied Biosystems, Carlsbad CA, USA). Równoważnik 5 ng RNA użyto do reakcji PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu Fast Advanced master mix i testu ekspresji genów (IRS1, GLUT4, BCKDHA, BCKDHB, ACOX, CPT1b, PLIN1, PLIN2, PLIN5, FASN, SCD1, DGAT2, PPAR-γ ; Biosystemy Stosowane). Wszystkie próbki analizowano w dwóch powtórzeniach. Ekspresję genów docelowych znormalizowano do ekspresji RPS13 (glukuronidaza, beta) i obliczono krotność zmiany ekspresji metodą delta delta Ct.

Widmo kwasów tłuszczowych w AT Widmo kwasów tłuszczowych w AT oceniano za pomocą chromatografii gazowej, metody opisanej już przez Lepage i Roy [13] z modyfikacjami Rodrigueza-Palmero i in. [14] W skrócie, metoda obejmuje ekstrakcję chloroformem/metanolem liofilizowanego AT w celu wyizolowania lipidów, a następnie transestryfikację lub estryfikację FA związanego z lipidami w celu utworzenia estrów metylowych, które następnie analizowano za pomocą chromatografii gazowej.

Analiza statystyczna Dane przedstawiono w tekście, tabelach i na rysunkach jako średnie ± SD z 95% przedziałem ufności, a wartości p <0,05 uznano za istotne statystycznie. Test t-Studenta zastosowano w próbkach obserwacyjnych dla danych o rozkładzie normalnym. Test par Wilcoxona stosowano, gdy dane nie miały rozkładu normalnego. Próbki interwencyjne porównano przy użyciu ogólnego modelu liniowego, aby przetestować istotność statystyczną różnic między grupami. Do oceny interakcji grupa × czas zastosowano model mieszany ANOVA. W obrębie każdej grupy efekty czasowe interwencji oceniano za pomocą ANOVA z powtarzanymi pomiarami z wielokrotnym porównaniem Bonferroniego. Tam, gdzie w każdej grupie były tylko dwa zestawy danych (tj. tylko dane wyjściowe i interwencyjne, jak w przypadku danych uzyskanych z biopsji tkanek), sparowane testy t zostały użyte dla danych o rozkładzie normalnym i testu Wilcoxona, gdy dane nie miały rozkładu normalnego. Współczynnik korelacji Pearsona obliczono w celu wyrażenia związku między zmianami od wartości wyjściowej do interwencji dla danych o rozkładzie normalnym, a współczynnik korelacji Spearmana obliczono, gdy dane nie miały rozkładu normalnego. Do wykonania wszystkich procedur statystycznych wykorzystano program Statistica 9.0, StatSoft, Inc. USA.