Efeitos da Exposição Dietética Crônica a Aminoácidos de Cadeia Ramificada

Assuntos e métodos Listados em outro lugar Intervenção Listado em outro lugar

Exame clínico Cada indivíduo foi submetido a um check-up médico básico com exame antropométrico (altura (m), peso (kg), IMC (kg/m2), circunferência da cintura (cm), relação cintura-quadril). A composição corporal foi medida usando análise de bioimpedância (BIA, Nutriguard-M, Data Input GmbH, Alemanha). Cada uma das medições acima mencionadas foi realizada três vezes e a média foi registrada.

Avaliação dietética Cada participante preencheu um questionário prospectivo, onde foram recolhidos dados dietéticos de 3 dias (2 dias úteis, 1 dia de fim-de-semana). Para cálculos de ingestão alimentar foi utilizado o programa Nutridan. Como os dados nutricionais de alguns produtos veganos especiais não estão disponíveis no banco de dados, os veganos foram solicitados a coletar embalagens desses produtos com conteúdo nutricional declarado pelo produtor, e esses dados foram usados ​​para cálculos. A ingestão de sacarídeos, lipídios e proteínas foi calculada separadamente. O conteúdo de BCAA de proteínas dietéticas foi estimado usando o banco de dados nutricional.

Avaliação da atividade física A atividade física foi avaliada em toda a amostra usando o questionário Baecke para atividade física habitual [1], que se correlaciona bem com o consumo máximo de oxigênio (VO2max) [2]. O teste de exercício máximo foi realizado em cada sujeito em uma bicicleta ergométrica freada eletromagneticamente (Ergoline 800, Bitz, Alemanha) para determinar o consumo máximo de oxigênio (Vo2pico). Uma carga de trabalho inicial de 50W foi aumentada em 25W a cada minuto continuamente até a fadiga, apesar do incentivo verbal. O consumo de oxigênio foi medido usando Vmax, Sensor Medics (Yorba Linda, CA). A frequência cardíaca foi monitorada continuamente.

Análise laboratorial O sangue venoso periférico foi coletado de cada indivíduo após 12 horas de jejum. Parâmetros de homeostase da glicose foram avaliados em laboratório hospitalar universitário certificado: glicose plasmática usando reação de hexoquinase (kit KONELAB, Alemanha), HbA1c usando cromatografia líquida de alta pressão com boronato afinit (Primus Corporation), insulina usando imunoensaio enzimático quimioluminescente competitivo em fase sólida (Immulite 2000) . Perfil lipídico: colesterol total e triglicerídeos foram medidos usando o método enzimático (kit KONELAB, Alemanha), HDL-colesterol usando medição enzimática modificada por PEG (kit ROCHE, Suíça). Os níveis plasmáticos de ácidos graxos livres (FFA) foram medidos usando o método já descrito [12]. Resumidamente, FFA foram extraídos juntamente com lipídios neutros usando isooctan e limpos por extração reversa. Os FA obtidos desta forma foram derivatizados a ésteres metílicos e posteriormente analisados ​​por cromatografia gasosa (GC). Os níveis séricos de AA foram determinados usando eletroforese capilar (EC) com detecção de condutividade sem contato, que já foi descrita em detalhes [3, 4]. As medições de CE foram realizadas usando o sistema HP3DCE (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemanha) equipado com um detector de condutividade sem contato embutido.

A sensibilidade e a secreção de insulina IS foram avaliadas usando pinça euglicêmica hiperinsulinêmica de 2 horas, método descrito em outro lugar [5]. O clampeamento foi realizado após jejum de 12 horas em dose padrão de insulina 1mIU/kg/min e foi utilizada infusão de solução glicosada a 15%. A taxa média de infusão no estado estacionário da pinça (6 medições consecutivas) foi usada para medições. A eliminação de glicose foi expressa como taxa de depuração metabólica (MCR, ml.kg-1.min-1) após correção para alterações no pool de glicose no líquido extracelular (correção do espaço) e índice de sensibilidade à insulina (MCR dividido pela insulina no estado estatal, MCR/I, ml.kg-1.min-1/mU.l-1). A secreção de insulina foi avaliada pelo teste de arginina IV, conforme já descrito [6], realizado em um dia diferente (com cerca de 7 dias de intervalo) do clamp de glicose. A resposta aguda à insulina foi calculada como a área trapezoidal incremental para a insulina durante os 30 minutos do teste.

Biópsia muscular, cadeia respiratória e atividades das enzimas citrato sintase A amostra do músculo esquelético do músculo vasto lateral foi realizada em todos os participantes usando uma técnica padrão de Bergström [7, 8]. A biópsia foi realizada em condições de jejum. Obteve-se cerca de 200 mg de peso húmido. A amostra foi imediatamente microdissecada, pesada, dividida para as respectivas análises e congelada em nitrogênio líquido e armazenada a -80oC até as análises.

A atividade enzimática da cadeia respiratória (RC) mitocondrial e a atividade da citrato sintase (CS) foram medidas espectrofotometricamente em homogeneizados musculares. Os homogenatos de músculo foram preparados conforme descrito [9]. Resumidamente, cerca de 50 mg de SM foram cortados em pequenos fragmentos e homogeneizados (triturador de vidro) em 20 volumes de tampão de homogeneização gelado (250 mM de sacarose, 20 mM de Tris, 40 mM de KCl, 2 mM de EGTA, coquetel de inibidores de protease, pH 7,4). Os homogeneizados foram então centrifugados por 1 min a 600g a 4°C e os sobrenadantes foram imediatamente utilizados para análise. A concentração de proteína foi medida em alíquotas usando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (Sigma). A atividade do complexo I-IV e CS foi determinada de acordo com protocolos publicados anteriormente [10-11], que foram modificados para medição em um leitor de microplacas (Infinite M200 PRO, Tecan). Todas as medições foram feitas em tetraplicatas. As atividades de RC e CS foram expressas em nmol/min/mg de proteínas totais, exceto para o complexo IV, que foi expressa em Δ log (A550)/min/mg de proteínas totais. As atividades enzimáticas dos complexos RC também foram normalizadas para a atividade do CS, que é usado como marcador da abundância de mitocôndrias dentro de um tecido.

Biópsia de tecido adiposo A biópsia de tecido adiposo abdominal subcutâneo (SAAT) foi realizada em todos os participantes. A agulha de Bergström foi utilizada para obter amostras de gordura subcutânea da região paraumbilical conforme já descrito [12]. A biópsia foi realizada em condições de jejum. Cerca de 300 mg de peso úmido foram obtidos. A amostra foi imediatamente microdissecada, pesada, dividida para as respectivas análises e congelada em nitrogênio líquido e armazenada a -80oC até as análises.

PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR) O RNA total dos tecidos foi isolado usando Lipid Tissue e Fibrous Tissue RNeasy Mini Kits (Qiagen). A concentração de RNA foi medida por Nanodrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, EUA). O RNA foi tratado com DNAse I (Invitrogen, Carlsbad CA, EUA) para remover qualquer DNA genômico contaminante. O cDNA foi preparado a partir de 200-600 ng de RNA usando o kit de arquivamento de cDNA de alta capacidade (Applied Biosystems, Carlsbad CA, EUA). Equivalente a 5 ng de RNA foi usado para reações de PCR em tempo real usando Fast Advanced master mix e ensaio de expressão gênica (IRS1, GLUT4, BCKDHA, BCKDHB, ACOX, CPT1b, PLIN1, PLIN2, PLIN5, FASN, SCD1, DGAT2, PPAR-γ ; Biossistemas Aplicados). Todas as amostras foram executadas em duplicatas. A expressão gênica dos genes-alvo foi normalizada para a expressão de RPS13 (glucuronidase, beta) e a alteração da expressão foi calculada usando o método delta delta Ct.

Espectro de ácidos graxos na AT O espectro de ácidos graxos na AT foi avaliado por cromatografia gasosa, método já descrito por Lepage e Roy [13] com modificações por Rodriguez-Palmero et al. [14] Em resumo, o método envolve uma extração de clorofórmio/metanol de AT liofilizado para isolar lipídios e subsequente transesterificação ou esterificação de FA ligada a lipídios para formar ésteres metílicos, que foram então analisados ​​por cromatografia gasosa.

Análise estatística Os dados são apresentados em texto, tabelas e figuras como média ± DP com IC 95 % e valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. O teste t de Student foi usado em amostras observacionais para dados normalmente distribuídos. O teste de pares combinados de Wilcoxon foi usado quando os dados não apresentavam distribuição normal. As amostras de intervenção foram comparadas usando um modelo linear geral para testar a significância estatística das diferenças entre os grupos. Uma ANOVA de modelo misto foi usada para avaliar a interação grupo x tempo. Dentro de cada grupo, os efeitos de tempo da intervenção foram avaliados usando ANOVA de medidas repetidas com comparação múltipla de Bonferroni. Onde havia apenas dois conjuntos de dados dentro de cada grupo (ou seja, apenas dados de linha de base e de intervenção como em dados obtidos de biópsias de tecido) testes t pareados foram usados ​​para dados normalmente distribuídos e teste de Wilcoxon quando os dados não eram normalmente distribuídos. O coeficiente de correlação de Pearson foi calculado para expressar a relação entre as mudanças da linha de base para a intervenção para dados normalmente distribuídos e o coeficiente de correlação de Spearman foi calculado quando os dados não eram normalmente distribuídos. Statistica 9.0, StatSoft, Inc. EUA foi usado para realizar todos os procedimentos estatísticos.