Auswirkungen einer chronischen ernährungsbedingten Exposition gegenüber verzweigtkettigen Aminosäuren

An anderer Stelle aufgeführte Themen und Methoden Intervention An anderer Stelle aufgeführt

Klinische Untersuchung Jeder Proband wurde einer medizinischen Grunduntersuchung mit anthropometrischer Untersuchung (Größe (m), Gewicht (kg), BMI (kg/m2), Taillenumfang (cm), Taillen-Hüft-Verhältnis) unterzogen. Die Körperzusammensetzung wurde mittels Bioimpedanzanalyse (BIA, Nutriguard-M, Data Input GmbH, Deutschland) gemessen. Jede der oben erwähnten Messungen wurde dreimal durchgeführt und der Mittelwert aufgezeichnet.

Ernährungsbewertung Jeder Teilnehmer füllte einen prospektiven Fragebogen aus, in dem Ernährungsdaten von 3 Tagen erhoben wurden (2 Arbeitstage, 1 Wochenendtag). Für Berechnungen der Nahrungsaufnahme wurde das Nutridan-Programm verwendet. Da Nährwertdaten einiger spezieller veganer Produkte nicht in der Datenbank verfügbar sind, wurden Veganer gebeten, Verpackungen dieser Produkte mit vom Hersteller deklariertem Nährwert zu sammeln, und diese Daten wurden für Berechnungen verwendet. Saccharide, Lipid- und Proteinzufuhr wurden separat berechnet. Der BCAA-Gehalt von Nahrungsproteinen wurde unter Verwendung einer Ernährungsdatenbank geschätzt.

Bewertung der körperlichen Aktivität Die körperliche Aktivität wurde in der gesamten Stichprobe mithilfe des Baecke-Fragebogens für die habituelle körperliche Aktivität [1] bewertet, der gut mit dem maximalen Sauerstoffverbrauch (VO2max)[2] korreliert. Bei jedem Probanden wurde ein maximaler Belastungstest auf einem elektromagnetisch gebremsten Fahrradergometer (Ergoline 800, Bitz, Deutschland) durchgeführt, um die maximale Sauerstoffaufnahme (Vo2peak) zu bestimmen. Eine anfängliche Arbeitsbelastung von 50 W wurde trotz der verbalen Ermutigung kontinuierlich jede Minute um 25 W bis zur Ermüdung gesteigert. Die Sauerstoffaufnahme wurde unter Verwendung von Vmax, Sensor Medics (Yorba Linda, CA) gemessen. Die Herzfrequenz wurde kontinuierlich überwacht.

Laboranalyse Peripheres venöses Blut wurde jedem Probanden nach 12 Stunden Fasten entnommen. Die Parameter der Glukose-Homöostase wurden in einem zertifizierten Labor einer Universitätsklinik bestimmt: Plasmaglukose mittels Hexokinase-Reaktion (Kit KONELAB, Deutschland), HbA1c mittels Hochdruck-Flüssigkeits-Boronat-Afinit-Chromatographie (Primus Corporation), Insulin mittels kompetitivem Festphasen-Chemilumineszenz-Enzym-Immunoassay (Immulite 2000) . Lipidprofil: Gesamtcholesterin und Triglyceride wurden mit enzymatischer Methode (Kit KONELAB, Deutschland), HDL-Cholesterin mit PEG-modifizierter enzymatischer Messung (Kit ROCHE, Schweiz) gemessen. Plasmaspiegel von freien Fettsäuren (FFA) wurden unter Verwendung des bereits beschriebenen Verfahrens gemessen [12]. Kurz gesagt wurden FFA zusammen mit neutralen Lipiden unter Verwendung von Isooctan extrahiert und durch Umkehrextraktion gereinigt. Die so gewonnenen FS wurden zu Methylestern derivatisiert und anschließend mittels Gaschromatographie (GC) analysiert. Die Serum-AA-Spiegel wurden mittels Kapillarelektrophorese (CE) mit berührungsloser Leitfähigkeitsdetektion bestimmt, die bereits ausführlich beschrieben wurde [3, 4]. CE-Messungen wurden unter Verwendung eines HP3DCE-Systems (Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) durchgeführt, das mit einem eingebauten kontaktlosen Leitfähigkeitsdetektor ausgestattet war.

Insulinsensitivität und -sekretions-IS wurden mit einer 2-stündigen hyperinsulinämischen euglykämischen Klemme bewertet, einer Methode, die an anderer Stelle beschrieben ist[5]. Die Klemmung wurde nach 12-stündigem Fasten in einer Standard-Insulindosis von 1 mIU/kg/min durchgeführt, und es wurde eine Infusion mit 15 % Glucoselösung verwendet. Für die Messungen wurde die mittlere Infusionsrate im stationären Zustand der Klemme (6 aufeinanderfolgende Messungen) verwendet. Die Glukoseverwertung wurde als metabolische Clearance-Rate (MCR, ml.kg-1.min-1) ausgedrückt. nach Korrektur für Veränderungen im Glukosepool in der extrazellulären Flüssigkeit (Raumkorrektur) und Insulinsensitivitätsindex (MCR geteilt durch Insulinämie im Stady-Zustand, MCR/I, ml.kg-1.min-1/mU.l-1). Die Insulinsekretion wurde durch einen IV-Arginintest, wie bereits beschrieben [6], bestimmt, der an einem anderen Tag (ungefähr 7 Tage dazwischen) von der Glukoseklemme durchgeführt wurde. Die akute Insulinreaktion wurde als inkrementelle trapezförmige Fläche für Insulin während der 30 Minuten des Tests berechnet.

Muskelbiopsie, Aktivitäten der Atmungskette und Citratsynthase-Enzyme Eine Skelettmuskelprobe aus dem Vastus lateralis-Muskel wurde bei jedem Teilnehmer unter Verwendung einer Standard-Bergström-Technik durchgeführt [7, 8]. Die Biopsie wurde unter nüchternen Bedingungen durchgeführt. Es wurden etwa 200 mg Nassgewicht erhalten. Die Probe wurde sofort mikrodisseziert, gewogen, für die jeweiligen Analysen geteilt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Analyse bei -80 °C gelagert.

Die enzymatische Aktivität der mitochondrialen Atmungskette (RC) und die Aktivität der Citratsynthase (CS) wurden spektrophotometrisch in Muskelhomogenaten gemessen. Muskelhomogenate wurden wie beschrieben hergestellt [9]. Kurz gesagt, etwa 50 mg SM wurden in kleine Fragmente geschnitten und in 20 Volumina eiskaltem Homogenisierungspuffer (250 mM Saccharose, 20 mM Tris, 40 mM KCl, 2 mM EGTA, Protease-Inhibitor-Cocktail, pH-Wert 7,4). Die Homogenate wurden dann für 1 Minute bei 600 g bei 4°C zentrifugiert und die Überstände wurden sofort für die Analyse verwendet. Die Proteinkonzentration wurde in Aliquots unter Verwendung des Bicinchoninsäure(BCA)-Assays (Sigma) gemessen. Die Aktivität der Komplexe I–IV und CS wurde gemäß zuvor veröffentlichten Protokollen [10–11] bestimmt, die für die Messung in einem Mikroplatten-Lesegerät (Infinite M200 PRO, Tecan) modifiziert wurden. Alle Messungen wurden in Tetraplicates durchgeführt. Die Aktivitäten von RC und CS wurden als nmol/min/mg Gesamtproteine ​​ausgedrückt, mit Ausnahme von Komplex IV, der als Δ log (A550)/min/mg Gesamtproteine ​​ausgedrückt wurde. Die enzymatischen Aktivitäten der RC-Komplexe wurden auch auf die Aktivität von CS normalisiert, die als Marker für die Häufigkeit von Mitochondrien in einem Gewebe verwendet wird.

Fettgewebsbiopsie Bei jedem Teilnehmer wurde eine Biopsie des subkutanen abdominalen Fettgewebes (SAAT) durchgeführt. Eine Bergström-Nadel wurde verwendet, um Proben von subkutanem Fett aus dem paraumbilikalen Bereich zu erhalten, wie bereits beschrieben [12]. Die Biopsie wurde unter nüchternen Bedingungen durchgeführt. Es wurden etwa 300 mg Nassgewicht erhalten. Die Probe wurde sofort mikrodisseziert, gewogen, für die jeweiligen Analysen geteilt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Analyse bei -80 °C gelagert.

Quantitative Echtzeit-PCR (RT-qPCR) Gesamt-RNA aus Geweben wurde mit Lipid Tissue und Fibrous Tissue RNeasy Mini Kits (Qiagen) isoliert. Die RNA-Konzentration wurde mit Nanodrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, USA) gemessen. RNA wurde mit DNAse I (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) behandelt, um jegliche kontaminierende genomische DNA zu entfernen. cDNA wurde aus 200–600 ng RNA unter Verwendung des High Capacity cDNA Archive Kits (Applied Biosystems, Carlsbad CA, USA) präpariert. Das Äquivalent von 5 ng RNA wurde für Echtzeit-PCR-Reaktionen unter Verwendung von Fast Advanced Mastermix und Genexpressionsassay (IRS1, GLUT4, BCKDHA, BCKDHB, ACOX, CPT1b, PLIN1, PLIN2, PLIN5, FASN, SCD1, DGAT2, PPAR-γ) verwendet ; Angewandte Biosysteme). Alle Proben wurden in Duplikaten durchgeführt. Die Genexpression der Zielgene wurde auf die Expression von RPS13 (Glucuronidase, beta) normalisiert und die fache Änderung der Expression wurde unter Verwendung der Delta-Delta-Ct-Methode berechnet.

Fettsäurespektrum in AT Das Fettsäurespektrum in AT wurde mittels Gaschromatographie bewertet, einer Methode, die bereits von Lepage und Roy [13] mit Modifikationen von Rodriguez-Palmero et al. beschrieben wurde. [14] Kurz gesagt umfasst das Verfahren eine Chloroform/Methanol-Extraktion von gefriergetrocknetem AT zur Isolierung von Lipiden und anschließende Umesterung oder Veresterung von an Lipide gebundenen FA zur Bildung von Methylestern, die dann mittels Gaschromatographie analysiert wurden.

Statistische Analyse Die Daten werden in Text, Tabellen und Abbildungen als Mittelwerte ± Standardabweichung mit 95 % KI und p-Werten < 0,05 als statistisch signifikant angesehen. Der Student-t-Test wurde in Beobachtungsstichproben für normalverteilte Daten verwendet. Der Matched-Pairs-Test von Wilcoxon wurde verwendet, wenn die Daten nicht normalverteilt waren. Interventionsproben wurden unter Verwendung eines allgemeinen linearen Modells verglichen, um die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen den Gruppen zu testen. Eine Mischmodell-ANOVA wurde verwendet, um die Gruppen-Zeit-Interaktion zu bewerten. Innerhalb jeder Gruppe wurden die Zeiteffekte der Intervention unter Verwendung von ANOVA mit wiederholten Messungen mit Mehrfachvergleich nach Bonferroni bewertet. Wo es nur zwei Datensätze innerhalb jeder Gruppe gab (d.h. nur Baseline- und Interventionsdaten wie bei Daten aus Gewebebiopsien) wurden gepaarte t-Tests für normalverteilte Daten und Wilcoxon-Test verwendet, wenn Daten nicht normalverteilt waren. Der Korrelationskoeffizient von Pearson wurde berechnet, um die Beziehung zwischen Änderungen von der Baseline bis zur Intervention für normalverteilte Daten auszudrücken, und der Korrelationskoeffizient von Spearman wurde berechnet, wenn die Daten nicht normalverteilt waren. Zur Durchführung aller statistischen Verfahren wurde Statistica 9.0, StatSoft, Inc. USA verwendet.