Эффекты хронического воздействия аминокислот с разветвленной цепью с пищей

Субъекты и методы Перечислены в другом месте Вмешательство Перечислено в другом месте

Клиническое обследование Каждый субъект прошел базовое медицинское обследование с антропометрическим исследованием (рост (м), вес (кг), ИМТ (кг/м2), окружность талии (см), соотношение талии и бедер). Состав тела измеряли с помощью биоимпедансного анализа (BIA, Nutriguard-M, Data Input GmbH, Германия). Каждое из вышеупомянутых измерений выполняли три раза и регистрировали среднее значение.

Оценка диеты Каждый участник заполнил проспективную анкету, в которой были собраны данные о диете за 3 дня (2 рабочих дня, 1 выходной день). Для расчета рациона питания использовалась программа Nutridan. Поскольку данные о пищевой ценности некоторых специальных веганских продуктов отсутствуют в базе данных, веганам было предложено собрать упаковки этих продуктов с заявленной производителем пищевой ценностью, и эти данные использовались для расчетов. Потребление сахаров, липидов и белков рассчитывали отдельно. Содержание BCAA в пищевых белках оценивали с использованием базы данных о питании.

Оценка физической активности Физическая активность оценивалась в целом по выборке с использованием опросника Baecke для привычной физической активности [1], хорошо коррелирующего с максимальным потреблением кислорода (VO2max) [2]. Тест на максимальную нагрузку проводился у каждого испытуемого на велоэргометре с электромагнитным тормозом (Ergoline 800, Bitz, Германия) для определения пикового потребления кислорода (Vo2peak). Первоначальная рабочая нагрузка в 50 Вт непрерывно увеличивалась на 25 Вт каждую минуту до утомления, несмотря на словесное поощрение. Поглощение кислорода измеряли с помощью Vmax, Sensor Medics (Yorba Linda, CA). Частоту сердечных сокращений контролировали непрерывно.

Лабораторный анализ Периферическая венозная кровь была взята у каждого субъекта после 12 часов голодания. Параметры гомеостаза глюкозы оценивались в сертифицированной лаборатории университетской больницы: глюкоза плазмы с помощью гексокиназной реакции (набор KONELAB, Германия), HbA1c с помощью жидкостной боронатной хроматографии высокого давления (Primus Corporation), инсулин с помощью твердофазного конкурентного хемилюминесцентного иммуноферментного анализа (Immulite 2000). . Липидный профиль: общий холестерин и триглицериды определяли ферментативным методом (набор KONELAB, Германия), холестерин ЛПВП – с помощью модифицированного ПЭГ ферментативного измерения (набор ROCHE, Швейцария). Уровни свободных жирных кислот (СЖК) в плазме измеряли с использованием уже описанного метода [12]. Вкратце, СЖК экстрагировали вместе с нейтральными липидами с использованием изооктана и очищали обратной экстракцией. Полученные таким образом ЖК дериватизировали в метиловые эфиры и затем анализировали с помощью газовой хроматографии (ГХ). Уровни АК в сыворотке крови определяли методом капиллярного электрофореза (КЭ) с бесконтактным определением электропроводности, который уже подробно описан [3, 4]. Измерения КЭ проводились с использованием системы HP3DCE (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany), оснащенной встроенным бесконтактным детектором проводимости.

Чувствительность к инсулину и ИС секреции оценивали с помощью 2-часового гиперинсулинемического эугликемического клэмпа, описанного в другом месте [5]. Зажим проводили после 12-часового голодания в стандартной дозе инсулина 1 мМЕ/кг/мин и использовали инфузию 15 % раствора глюкозы. Для измерений использовалась средняя скорость инфузии в стационарном состоянии зажима (6 последовательных измерений). Утилизацию глюкозы выражали как скорость метаболического клиренса (MCR, мл.кг-1.мин-1). после поправки на изменения пула глюкозы во внеклеточной жидкости (пространственная коррекция) и индекса чувствительности к инсулину (MCR, деленная на стационарную инсулинемию, MCR/I, мл.кг-1.мин-1/мЕ.л-1). Секрецию инсулина оценивали с помощью внутривенного аргининового теста, как уже описано [6], проводимого в другой день (с интервалом примерно 7 дней) после клэмп-теста с глюкозой. Острый инсулиновый ответ рассчитывали как приращение трапециевидной площади для инсулина в течение 30 минут теста.

Мышечная биопсия, активность дыхательной цепи и ферментов цитратсинтазы Образец скелетной мышцы из латеральной широкой мышцы бедра был выполнен у каждого участника с использованием стандартной методики Бергстрема [7, 8]. Биопсия проводилась натощак. Получали около 200 мг сырой массы. Образец немедленно подвергали микродиссекции, взвешивали, разделяли для соответствующих анализов, быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C до проведения анализов.

Ферментативную активность митохондриальной дыхательной цепи (RC) и активность цитратсинтазы (CS) измеряли спектрофотометрически в гомогенатах мышц. Гомогенаты мышц готовили, как описано [9]. Вкратце, около 50 мг СМ разрезали на мелкие фрагменты и гомогенизировали (шлифовальная машина для стекла) в 20 объемах охлажденного льдом буфера для гомогенизации (250 мМ сахарозы, 20 мМ Трис, 40 мМ KCl, 2 мМ EGTA, смесь ингибиторов протеаз, рН 7,4). Затем гомогенаты центрифугировали в течение 1 мин при 600g при 4°С и сразу использовали супернатанты для анализа. Концентрацию белка измеряли в аликвотах с использованием анализа на бицинхониновую кислоту (BCA) (Sigma). Активность комплекса I-IV и ХС определяли в соответствии с ранее опубликованными протоколами [10-11], которые были модифицированы для измерения в микропланшетовом ридере (Infinite M200 PRO, Tecan). Все измерения проводились в четырехкратной повторности. Активность РЦ и ХС выражали в нмоль/мин/мг общих белков, за исключением комплекса IV, который выражали в виде Δ log (А550)/мин/мг общих белков. Ферментативную активность комплексов РЦ также нормализовали по активности ХС, который используется в качестве маркера обилия митохондрий в ткани.

Биопсия жировой ткани проводилась у каждого участника. Для получения образцов подкожного жира из околопупочной области использовали иглу Бергстрема, как уже описано [12]. Биопсия проводилась натощак. Получали около 300 мг сырой массы. Образец немедленно подвергали микродиссекции, взвешивали, разделяли для соответствующих анализов, быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C до проведения анализов.

Количественная ПЦР в реальном времени (RT-qPCR). Тотальную РНК из тканей выделяли с использованием мини-наборов Lipid Tissue и Fibrous Tissue RNeasy Mini Kit (Qiagen). Концентрацию РНК измеряли с помощью Nanodrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Уилмингтон, США). РНК обрабатывали ДНКазой I (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) для удаления любой загрязняющей геномной ДНК. кДНК получали из 200-600 нг РНК с использованием архивного набора кДНК High Capacity (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния, США). Эквивалент 5 нг РНК использовали для реакций ПЦР в реальном времени с использованием мастер-микса Fast Advanced и анализа экспрессии генов (IRS1, GLUT4, BCKDHA, BCKDHB, ACOX, CPT1b, PLIN1, PLIN2, PLIN5, FASN, SCD1, DGAT2, PPAR-γ). ; Прикладные биосистемы). Все образцы запускали в дублях. Экспрессию генов-мишеней нормализовали по экспрессии RPS13 (глюкуронидаза, бета) и рассчитывали кратность изменения экспрессии с использованием метода дельта-дельта Ct.

Спектр жирных кислот в AT Спектр жирных кислот в AT оценивали с помощью газовой хроматографии, метода, уже описанного Lepage и Roy [13] с модификациями Rodriguez-Palmero et al. [14] Вкратце, метод включает экстракцию лиофилизированной АТ хлороформом/метанолом для выделения липидов и последующую переэтерификацию или этерификацию ЖК, связанных с липидами, с образованием метиловых эфиров, которые затем анализируют с помощью газовой хроматографии.

Статистический анализ Данные представлены в тексте, таблицах и рисунках в виде средних значений ± стандартное отклонение с 95 % ДИ, а значения p <0,05 считались статистически значимыми. Критерий Стьюдента использовался в выборках наблюдений для нормально распределенных данных. Критерий согласованных пар Уилкоксона использовался, когда данные не были распределены нормально. Выборки для вмешательства сравнивали с использованием общей линейной модели для проверки статистической значимости различий между группами. Смешанная модель ANOVA использовалась для оценки взаимодействия группы и времени. В каждой группе временные эффекты вмешательства оценивались с использованием повторных измерений ANOVA с множественным сравнением Бонферрони. Если в каждой группе было только два набора данных (т. только исходные данные и данные о вмешательстве, как в данных, полученных из биопсии ткани), парные t-критерии использовались для нормально распределенных данных и критерий Уилкоксона, когда данные не были нормально распределены. Коэффициент корреляции Пирсона был рассчитан для выражения отношения между изменениями от исходного уровня до вмешательства для нормально распределенных данных, а коэффициент корреляции Спирмена был рассчитан, когда данные не были нормально распределены. Для выполнения всех статистических процедур использовалась программа Statistica 9.0, StatSoft, Inc. USA.