Účinky chronické dietní expozice aminokyselinám s rozvětveným řetězcem

Předměty a metody Jinde uvedeny Intervence Jinde uvedeny

Klinické vyšetření Každý subjekt prošel základní lékařskou prohlídkou s antropometrickým vyšetřením (výška (m), hmotnost (kg), BMI (kg/m2), obvod pasu (cm), poměr pas-boky. Tělesné složení bylo měřeno pomocí bioimpedanční analýzy (BIA, Nutriguard-M, Data Input GmbH, Německo). Každé z výše uvedených měření bylo provedeno třikrát a byl zaznamenán průměr.

Hodnocení stravy Každý účastník vyplnil prospektivní dotazník, kde byly shromážděny údaje o stravě za 3 dny (2 pracovní dny, 1 víkendový den). Pro výpočty dietního příjmu byl použit program Nutridan. Vzhledem k tomu, že nutriční údaje některých speciálních veganských produktů nejsou v databázi k dispozici, byli vegani požádáni, aby vyzvedli obaly od těchto produktů s nutričním obsahem deklarovaným výrobcem a tato data byla použita pro výpočty. Příjem sacharidů, lipidů a bílkovin byl vypočítán samostatně. Obsah BCAA v dietních proteinech byl odhadnut pomocí nutriční databáze.

Hodnocení fyzické aktivity Pohybová aktivita byla v celém souboru hodnocena pomocí Baeckeho dotazníku pro obvyklou pohybovou aktivitu [1], která dobře koreluje s maximální spotřebou kyslíku (VO2max)[2]. U každého subjektu byl proveden maximální zátěžový test na elektromagneticky brzděném cyklistickém ergometru (Ergoline 800, Bitz, Německo) ke stanovení maximálního příjmu kyslíku (Vo2peak). Počáteční pracovní zátěž 50 W byla zvyšována o 25 W každou minutu nepřetržitě až do únavy navzdory slovnímu povzbuzování. Příjem kyslíku byl měřen pomocí Vmax, Sensor Medics (Yorba Linda, CA). Srdeční frekvence byla nepřetržitě monitorována.

Laboratorní analýza Po 12 hodinách hladovění byla každému subjektu odebrána periferní žilní krev. Parametry homeostázy glukózy byly hodnoceny v certifikované laboratoři Fakultní nemocnice: plazmatická glukóza pomocí hexokinázové reakce (sada KONELAB, Německo), HbA1c pomocí vysokotlaké kapalinové boronátové afinitní chromatografie (Primus corporation), inzulín pomocí kompetitivní chemiluminiscenční enzymové imunoanalýzy na pevné fázi (Immulite 2000) . Lipidový profil: celkový cholesterol a triglyceridy byly měřeny pomocí enzymatické metody (souprava KONELAB, Německo), HDL-cholesterol pomocí PEG modifikovaného enzymatického měření (souprava ROCHE, Švýcarsko). Plazmatické hladiny volných mastných kyselin (FFA) byly měřeny již popsanou metodou [12]. Stručně, FFA byly extrahovány společně s neutrálními lipidy pomocí isooktanu a vyčištěny reverzní extrakcí. Takto získané FA byly derivatizovány na methylestery a následně analyzovány pomocí plynové chromatografie (GC). Hladiny AA v séru byly stanoveny pomocí kapilární elektroforézy (CE) s bezkontaktní vodivostní detekcí, která již byla podrobně popsána [3, 4]. CE měření byla provedena pomocí systému HP3DCE (Agilent Technologies, Waldbronn, Německo) vybaveného vestavěným bezkontaktním detektorem vodivosti.

Inzulinová senzitivita a sekreční IS byly hodnoceny pomocí 2hodinového hyperinzulinemického euglykemického clampu, metodou popsanou jinde[5]. Svorka byla provedena po 12 hodinách hladovění ve standardní dávce inzulínu 1 mIU/kg/min a byla použita infuze 15% roztoku glukózy. Pro měření byla použita střední rychlost infuze v ustáleném stavu svorky (6 po sobě jdoucích měření). Likvidace glukózy byla vyjádřena jako rychlost metabolické clearance (MCR, ml.kg-1.min-1) po korekci na změny v glukózovém poolu v extracelulární tekutině (korekce prostoru) a indexu citlivosti na inzulín (MCR děleno inzulinémií v ustáleném stavu, MCR/I, ml.kg-1.min-1/mU.l-1). Sekrece inzulínu byla hodnocena IV argininovým testem, jak již bylo popsáno [6], provedeným v jiný den (asi 7 dní mezitím) od glukózového clampu. Akutní inzulínová odpověď byla vypočtena jako přírůstková lichoběžníková plocha pro inzulín během 30 minut testu.

Svalová biopsie, aktivity enzymů dýchacího řetězce a citrátsyntázy Vzorek kosterního svalu z m. vastus lateralis byl proveden u každého účastníka standardní Bergströmovou technikou[7, 8]. Biopsie byla provedena nalačno. Bylo získáno asi 200 mg vlhké hmotnosti. Vzorek byl okamžitě mikrodisekován, zvážen, rozdělen pro příslušné analýzy a rychle zmražen v kapalném dusíku a skladován při -80 °C až do analýzy.

Enzymatická aktivita mitochondriálního respiračního řetězce (RC) a aktivita citrátsyntázy (CS) byly měřeny spektrofotometricky ve svalových homogenátech. Svalové homogenáty byly připraveny podle popisu [9]. Stručně, asi 50 mg SM bylo nakrájeno na malé fragmenty a homogenizováno (mlýnek se sklem) ve 20 objemech ledově chladného homogenizačního pufru (250 mM sacharóza, 20 mM Tris, 40 mM KCl, 2 mM EGTA, koktejl inhibitorů proteázy, pH 7,4). Homogenáty byly poté centrifugovány po dobu 1 minuty při 600 g při 4 °C a supernatanty byly okamžitě použity pro analýzu. Koncentrace proteinu byla měřena v alikvotech pomocí testu bicinchonové kyseliny (BCA) (Sigma). Aktivita komplexu I-IV a CS byla stanovena podle dříve publikovaných protokolů [10-11], které byly upraveny pro měření ve čtečce mikrodestiček (Infinite M200 PRO, Tecan). Všechna měření byla provedena v tetraplikátech. Aktivity RC a CS byly vyjádřeny jako nmol/min/mg celkových proteinů, s výjimkou komplexu IV, který byl vyjádřen jako Δ log (A550)/min/mg celkových proteinů. Enzymatické aktivity RC komplexů byly také normalizovány na aktivitu CS, která se používá jako marker množství mitochondrií v tkáni.

Biopsie tukové tkáně U každého účastníka byla provedena biopsie subkutánní abdominální tukové tkáně (SAAT). Bergströmova jehla byla použita k získání vzorků podkožního tuku z paraumbilikální oblasti, jak již bylo popsáno [12]. Biopsie byla provedena nalačno. Bylo získáno asi 300 mg vlhké hmotnosti. Vzorek byl okamžitě mikrodisekován, zvážen, rozdělen pro příslušné analýzy a rychle zmražen v kapalném dusíku a skladován při -80 °C až do analýzy.

Kvantitativní PCR v reálném čase (RT-qPCR) Celková RNA z tkání byla izolována pomocí souprav Lipid Tissue a Fibrous Tissue RNeasy Mini Kit (Qiagen). Koncentrace RNA byla měřena pomocí Nanodrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, USA). RNA byla ošetřena DNAázou I (Invitrogen, Carlsbad CA, USA), aby se odstranila jakákoli kontaminující genomová DNA. cDNA byla připravena z 200-600 ng RNA pomocí vysokokapacitní archivační sady cDNA (Applied Biosystems, Carlsbad CA, USA). Ekvivalent 5 ng RNA byl použit pro PCR reakce v reálném čase pomocí Fast Advanced master mix a Gene expression assay (IRS1, GLUT4, BCKDHA, BCKDHB, ACOX, CPT1b, PLIN1, PLIN2, PLIN5, FASN, SCD1, DGAT2, PPAR-γ Applied Biosystems). Všechny vzorky byly testovány v duplikátech. Genová exprese cílových genů byla normalizována na expresi RPS13 (glukuronidáza, beta) a pomocí metody delta delta Ct byla vypočtena násobná změna exprese.

Spektrum mastných kyselin v AT Spektrum mastných kyselin v AT bylo hodnoceno pomocí plynové chromatografie, metody již popsané Lepagem a Royem [13] s modifikacemi Rodriguez-Palmero et al. [14] Stručně řečeno, metoda zahrnuje extrakci chloroformem/methanolem lyofilizovaného AT za účelem izolace lipidů a následnou transesterifikaci nebo esterifikaci FA vázaného na lipidy za vzniku methylesterů, které byly následně analyzovány pomocí plynové chromatografie.

Statistická analýza Data jsou prezentována v textu, tabulkách a obrázcích jako průměr ± SD s 95 % CI a p-hodnoty <0,05 byly považovány za statisticky významné. Studentův t-test byl použit v pozorovacích vzorcích pro normálně rozložená data. Wilcoxonův párový test byl použit, když data nebyla normálně distribuována. Intervenční vzorky byly porovnány za použití obecného lineárního modelu pro testování statistické významnosti rozdílů mezi skupinami. K posouzení interakce skupina × čas byl použit smíšený model ANOVA. V rámci každé skupiny byly časové účinky intervence hodnoceny pomocí opakovaného měření ANOVA s Bonferroniho vícenásobným srovnáním. Tam, kde byly v každé skupině pouze dva soubory dat (tj. pouze výchozí a intervenční data jako v datech získaných z tkáňových biopsií) byly použity párové t-testy pro normálně distribuovaná data a Wilcoxonův test, když data nebyla normálně distribuována. Pearsonův korelační koeficient byl vypočítán pro vyjádření vztahu mezi změnami od výchozí hodnoty k intervenci pro normálně rozložená data a Spearmanův korelační koeficient byl vypočten, když data nebyla normálně rozložena. K provedení všech statistických postupů byla použita Statistica 9.0, StatSoft, Inc. USA.