Haaraketjuisille aminohapoille altistumisen vaikutukset ruokavaliossa

Aiheet ja menetelmät Listattu muualla Interventio Listattu muualla

Kliininen tutkimus Jokaiselle koehenkilölle tehtiin peruslääkärintarkastus ja antropometrinen tutkimus (pituus (m), paino (kg), BMI (kg/m2), vyötärön ympärysmitta (cm), vyötärön ja lantion välinen suhde). Kehon koostumus mitattiin bioimpedanssianalyysillä (BIA, Nutriguard-M, Data Input GmbH, Saksa). Jokainen edellä mainituista mittauksista suoritettiin kolme kertaa ja keskiarvo kirjattiin.

Ruokavalion arviointi Jokainen osallistuja täytti prospektiivisen kyselylomakkeen, johon kerättiin ruokavaliotietoja 3 päivältä (2 työpäivää, 1 viikonloppupäivä). Ruokavalion saannin laskemiseen käytettiin Nutridan-ohjelmaa. Koska tietokannasta ei ole saatavilla joidenkin erikoisvegaanituotteiden ravintotietoja, vegaaneja pyydettiin keräämään näistä tuotteista valmistajan ilmoittamia ravintosisältöä sisältäviä pakkauksia, joita käytettiin laskelmissa. Sakkaridit, lipidit ja proteiinin saanti laskettiin erikseen. Ravinnon proteiinien BCAA-pitoisuus arvioitiin ravitsemustietokannan avulla.

Fyysisen aktiivisuuden arviointi Fyysistä aktiivisuutta arvioitiin koko otoksessa käyttäen Baecken kyselylomaketta tavanomaista fyysistä aktiivisuutta varten [1], joka korreloi hyvin maksimaalisen hapenkulutuksen (VO2max) kanssa[2]. Jokaiselle koehenkilölle suoritettiin maksimaalinen rasitustesti sähkömagneettisesti jarrutetulla polkupyöräergometrillä (Ergoline 800, Bitz, Saksa) huippuhapenoton (Vo2peak) määrittämiseksi. Alkuperäistä 50 W:n työtaakkaa lisättiin 25 W:lla joka minuutti jatkuvasti väsymykseen asti suullisesta rohkaisusta huolimatta. Hapenotto mitattiin käyttämällä Vmax, Sensor Medics (Yorba Linda, CA). Sykettä seurattiin jatkuvasti.

Laboratorioanalyysi Perifeerinen laskimoveri otettiin jokaiselta koehenkilöltä 12 tunnin paaston jälkeen. Glukoosin homeostaasin parametrit arvioitiin sertifioidussa yliopistosairaalan laboratoriossa: plasman glukoosi heksokinaasireaktiolla (kit KONELAB, Saksa), HbA1c korkeapaineisella nestemäisellä boronaattiafinit-kromatografialla (Primus Corporation), insuliini kiinteän faasin kompetitiivisella kemiluminesenssientsyymi-immunomäärityksellä (Immulite) 2 . Lipidiprofiili: kokonaiskolesteroli ja triglyseridit mitattiin käyttämällä entsymaattista menetelmää (kit KONELAB, Saksa), HDL-kolesteroli käyttämällä PEG-modifioitua entsymaattista mittausta (kit ROCHE, Sveitsi). Vapaiden rasvahappojen (FFA) tasot plasmassa mitattiin jo kuvatulla menetelmällä [12]. Lyhyesti sanottuna FFA uutettiin yhdessä neutraalien lipidien kanssa käyttämällä isooktaania ja puhdistettiin käänteisuutolla. Tällä tavalla saatu FA derivatisoitiin metyyliestereiksi ja analysoitiin sen jälkeen käyttämällä kaasukromatografiaa (GC). Seerumin AA-tasot määritettiin käyttämällä kapillaarielektroforeesia (CE) ja kontaktitonta johtavuuden havaitsemista, mikä on jo kuvattu yksityiskohtaisesti [3, 4]. CE-mittaukset suoritettiin HP3DCE-järjestelmällä (Agilent Technologies, Waldbronn, Saksa), joka oli varustettu sisäänrakennetulla kosketuksettomalla johtavuusilmaisimella.

Insuliiniherkkyys ja erityksen IS arvioitiin käyttämällä 2 tunnin hyperinsulineemista euglykeemistä puristinta, menetelmää on kuvattu muualla[5]. Puristus suoritettiin 12 tunnin paaston jälkeen normaalilla insuliiniannoksella 1 mIU/kg/min ja käytettiin 15 % glukoosiliuosta sisältävää infuusiota. Mittauksiin käytettiin keskimääräistä infuusionopeutta puristimen vakaassa tilassa (6 peräkkäistä mittausta). Glukoosin hävittäminen ilmaistiin metabolisena puhdistumanopeudena (MCR, ml.kg-1.min-1) solunulkoisen nesteen glukoosipoolin muutosten korjauksen (tilakorjaus) ja insuliiniherkkyysindeksin (MCR jaettuna pysyvän tilan insulinemialla, MCR/I, ml.kg-1.min-1/mU.l-1) jälkeen. Insuliinin eritys arvioitiin IV arginiinitestillä, kuten jo on kuvattu [6], joka suoritettiin eri päivänä (noin 7 päivän välein) glukoosipuristimesta. Akuutti insuliinivaste laskettiin insuliinin inkrementaalisena puolisuunnikkaan muotoisena alueena testin 30 minuutin aikana.

Lihasbiopsia, hengitysketju ja sitraattisyntaasientsyymien toiminta Luustolihasnäyte vastus lateralis -lihaksesta otettiin jokaiselle osallistujalle standardi Bergströmin tekniikalla[7, 8]. Biopsia suoritettiin paasto-olosuhteissa. Saatiin noin 200 mg märkäpainoa. Näyte leikattiin välittömästi mikroleikkauksella, punnittiin, jaettiin vastaavia analyysejä varten ja pikapakastettiin nestetypessä ja säilytettiin -80 oC:ssa analyyseihin asti.

Mitokondrioiden hengitysketjun (RC) entsymaattinen aktiivisuus ja sitraattisyntaasi (CS) aktiivisuus mitattiin spektrofotometrisesti lihashomogenaateista. Lihashomogenaatit valmistettiin kuvatulla tavalla [9]. Lyhyesti sanottuna noin 50 mg SM:ää leikattiin pieniksi fragmenteiksi ja homogenoitiin (lasi-lasimylly) 20 tilavuudessa jääkylmää homogenointipuskuria (250 mM sakkaroosia, 20 mM Tris, 40 mM KCl, 2 mM EGTA, proteaasi-inhibiittoricocktail, pH 7,4). Homogenaatteja sentrifugoitiin sitten 1 minuutin ajan 600 g:ssä 4 °C:ssa ja supernatantit käytettiin välittömästi analysointiin. Proteiinikonsentraatio mitattiin erissä käyttämällä bikinkoniinihappo (BCA) -määritystä (Sigma). Kompleksin I-IV ja CS:n aktiivisuus määritettiin aiemmin julkaistujen protokollien [10-11] mukaisesti, joita muunnettiin mittausta varten mikrolevylukijassa (Infinite M200 PRO, Tecan). Kaikki mittaukset tehtiin tetraplikaattina. RC:n ja CS:n aktiivisuudet ilmaistiin yksikköinä nmol/min/mg kokonaisproteiineja, paitsi kompleksi IV, joka ilmaistiin A log (A550)/min/mg kokonaisproteiineja. RC-kompleksien entsymaattiset aktiivisuudet normalisoitiin myös CS:n aktiivisuuteen, jota käytetään kudoksen mitokondrioiden runsauden markkerina.

Rasvakudosbiopsia Jokaiselle osallistujalle suoritettiin ihonalainen vatsan rasvakudos (SAAT) -biopsia. Bergströmin neulaa käytettiin ottamaan näytteitä ihonalaisesta rasvasta paraumbilic-alueelta, kuten on jo kuvattu [12]. Biopsia suoritettiin paasto-olosuhteissa. Saatiin noin 300 mg märkäpainoa. Näyte leikattiin välittömästi mikroleikkauksella, punnittiin, jaettiin vastaavia analyysejä varten ja pikapakastettiin nestetypessä ja säilytettiin -80 oC:ssa analyyseihin asti.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (RT-qPCR) Kokonais-RNA kudoksista eristettiin käyttämällä Lipid Tissue ja Fibrous Tissue RNeasy Mini Kits -pakkauksia (Qiagen). RNA-pitoisuus mitattiin Nanodrop1000:lla (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, USA). RNA:ta käsiteltiin DNAase I:llä (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) kontaminoivan genomisen DNA:n poistamiseksi. cDNA valmistettiin 200 - 600 ng:sta RNA:ta käyttämällä High Capacity cDNA -arkistopakkausta (Applied Biosystems, Carlsbad CA, USA). Vastaavasti 5 ng RNA:ta käytettiin reaaliaikaisissa PCR-reaktioissa käyttämällä Fast Advanced master mix and Gene-ekspressiomääritystä (IRS1, GLUT4, BCKDHA, BCKDHB, ACOX, CPT1b, PLIN1, PLIN2, PLIN5, FASN, SCD1, DGAT2, PPAR-γ ; Applied Biosystems). Kaikki näytteet ajettiin kahtena kappaleena. Kohdegeenien geeniekspressio normalisoitiin RPS13:n (glukuronidaasi, beeta) ilmentymiseen ja ilmentymisen kertainen muutos laskettiin delta delta Ct -menetelmällä.

Rasvahappospektri AT:ssa Rasvahappospektri AT:ssa arvioitiin käyttämällä kaasukromatografiaa, menetelmää, jonka ovat jo kuvanneet Lepage ja Roy [13] Rodriguez-Palmeron et ai. [14] Lyhyesti sanottuna menetelmä sisältää pakastekuivatun AT:n kloroformi/metanoliuuttamisen lipidien eristämiseksi ja sen jälkeen lipideihin sitoutuneen FA:n transesteröinnin tai esteröinnin muodostaen metyyliestereitä, jotka sitten analysoitiin kaasukromatografialla.

Tilastollinen analyysi Tiedot on esitetty tekstissä, taulukoissa ja kuvissa keskiarvoina ± SD 95 %:n luottamusvälillä ja p-arvoja <0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevinä. Havaintonäytteissä käytettiin Studentin t-testiä normaalijakautuneille tiedoille. Wilcoxonin sovitettua paritestiä käytettiin, kun tiedot eivät olleet normaalisti jakautuneet. Interventionäytteitä verrattiin yleisellä lineaarisella mallilla ryhmien välisten erojen tilastollisen merkitsevyyden testaamiseksi. Sekamallin ANOVAa käytettiin arvioimaan ryhmä × aika -vuorovaikutusta. Jokaisessa ryhmässä intervention aikavaikutukset arvioitiin käyttämällä toistuvia mittauksia ANOVA:lla Bonferronin moninkertaisella vertailulla. Kun kussakin ryhmässä oli vain kaksi tietojoukkoa (ts. vain lähtötilanne- ja interventiotiedot kuten kudosbiopsioista saaduissa tiedoissa) parillisia t-testejä käytettiin normaalisti jakautuneille tiedoille ja Wilcoxon-testille, kun tiedot eivät jakautuneet normaalisti. Pearsonin korrelaatiokerroin laskettiin ilmaisemaan suhdetta muutosten välillä lähtötilanteesta interventioon normaalisti jakautuneille tiedoille ja Spearmanin korrelaatiokerroin laskettiin, kun tiedot eivät olleet normaalisti jakautuneita. Statistica 9.0, StatSoft, Inc. USA käytettiin kaikkien tilastollisten toimenpiteiden suorittamiseen.