Effetti dell'esposizione dietetica cronica agli amminoacidi a catena ramificata

Soggetti e metodi Elencati altrove Intervento Elencati altrove

Visita clinica Ogni soggetto è stato sottoposto a visita medica di base con esame antropometrico (altezza (m), peso (kg), BMI (kg/m2), circonferenza vita (cm), rapporto vita-fianchi). La composizione corporea è stata misurata utilizzando l'analisi della bioimpedenza (BIA, Nutriguard-M, Data Input GmbH, Germania). Ciascuna delle misurazioni sopra menzionate è stata eseguita tre volte e la media è stata registrata.

Valutazione dietetica Ogni partecipante ha compilato un questionario prospettico, in cui sono stati raccolti i dati dietetici di 3 giorni (2 giorni lavorativi, 1 giorno del fine settimana). Per i calcoli dell'assunzione dietetica è stato utilizzato il programma Nutridan. Poiché i dati nutrizionali di alcuni prodotti vegani speciali non sono disponibili nel database, ai vegani è stato chiesto di ritirare le confezioni di questi prodotti con il contenuto nutrizionale dichiarato dal produttore e questi dati sono stati utilizzati per i calcoli. L'assunzione di saccaridi, lipidi e proteine ​​è stata calcolata separatamente. Il contenuto di BCAA delle proteine ​​alimentari è stato stimato utilizzando un database nutrizionale.

Valutazione dell'attività fisica L'attività fisica è stata valutata nell'intero campione utilizzando il questionario Baecke per l'attività fisica abituale [1], che si correla bene con il consumo massimo di ossigeno (VO2max)[2]. Il test di esercizio massimo è stato eseguito in ciascun soggetto su un ergometro da bicicletta frenato elettromagneticamente (Ergoline 800, Bitz, Germania) per determinare il picco di consumo di ossigeno (Vo2peak). Un carico di lavoro iniziale di 50 W è stato aumentato di 25 W ogni minuto ininterrottamente fino alla fatica nonostante l'incoraggiamento verbale. L'assorbimento di ossigeno è stato misurato utilizzando Vmax, Sensor Medics (Yorba Linda, CA). La frequenza cardiaca è stata monitorata continuamente.

Analisi di laboratorio Il sangue venoso periferico è stato prelevato da ciascun soggetto dopo 12 ore di digiuno. I parametri dell'omeostasi del glucosio sono stati valutati nel laboratorio certificato dell'ospedale universitario: glucosio plasmatico utilizzando la reazione di esochinasi (kit KONELAB, Germania), HbA1c utilizzando la cromatografia afinit di boronato liquido ad alta pressione (Primus corporation), insulina utilizzando il dosaggio immunoenzimatico competitivo in fase solida chemiluminescente (Immulite 2000) . Profilo lipidico: il colesterolo totale e i trigliceridi sono stati misurati utilizzando il metodo enzimatico (kit KONELAB, Germania), il colesterolo HDL utilizzando la misurazione enzimatica modificata con PEG (kit ROCHE, Svizzera). I livelli plasmatici di acidi grassi liberi (FFA) sono stati misurati utilizzando il metodo già descritto [12]. In breve, gli FFA sono stati estratti insieme ai lipidi neutri usando isoottano e puliti mediante estrazione inversa. Gli AF così ottenuti sono stati derivatizzati a metilesteri e successivamente analizzati mediante gascromatografia (GC). I livelli sierici di AA sono stati determinati utilizzando l'elettroforesi capillare (CE) con rilevazione della conducibilità senza contatto, che è già stata descritta in dettaglio [3, 4]. Le misurazioni CE sono state effettuate utilizzando il sistema HP3DCE (Agilent Technologies, Waldbronn, Germania) dotato di un rilevatore di conducibilità senza contatto integrato.

La sensibilità e la secrezione insulinica IS è stata valutata utilizzando il clamp euglicemico iperinsulinemico di 2 ore, metodo descritto altrove[5]. Il clamp è stato eseguito dopo 12 ore di digiuno con una dose standard di insulina 1 mIU/kg/min ed è stata utilizzata un'infusione di soluzione glucosata al 15%. Per le misurazioni è stata utilizzata la velocità media di infusione allo stato stazionario del morsetto (6 misurazioni consecutive). Lo smaltimento del glucosio è stato espresso come velocità di clearance metabolica (MCR, ml.kg-1.min-1) dopo correzione per i cambiamenti nel pool di glucosio nel liquido extracellulare (correzione dello spazio) e nell'indice di sensibilità all'insulina (MCR diviso per insulinemia allo stato stazionario, MCR/I, ml.kg-1.min-1/mU.l-1). La secrezione di insulina è stata valutata mediante test dell'arginina EV come già descritto [6] eseguito in un giorno diverso (a circa 7 giorni di distanza) dal clamp del glucosio. La risposta insulinica acuta è stata calcolata come area trapezoidale incrementale per l'insulina durante i 30 minuti del test.

Biopsia muscolare, catena respiratoria e attività degli enzimi citrato sintasi Il campione di muscolo scheletrico dal muscolo vasto laterale è stato eseguito in ogni partecipante utilizzando una tecnica Bergström standard [7, 8]. La biopsia è stata eseguita a digiuno. Si ottengono circa 200 mg di peso umido. Il campione è stato immediatamente microdissezionato, pesato, diviso per le rispettive analisi e congelato a scatto in azoto liquido e conservato a -80°C fino alle analisi.

L'attività enzimatica della catena respiratoria mitocondriale (RC) e l'attività della citrato sintasi (CS) sono state misurate spettrofotometricamente negli omogenati muscolari. Gli omogenati muscolari sono stati preparati come descritto [9]. In breve, circa 50 mg di SM sono stati tagliati in piccoli frammenti e omogeneizzati (macinino vetro-vetro) in 20 volumi di tampone di omogeneizzazione ghiacciato (250 mM saccarosio, 20 mM Tris, 40 mM KCl, 2 mM EGTA, cocktail di inibitori della proteasi, pH 7,4). Gli omogenati sono stati quindi centrifugati per 1 min a 600 g a 4°C e i surnatanti sono stati immediatamente utilizzati per l'analisi. La concentrazione proteica è stata misurata in aliquote utilizzando il test dell'acido bicinconinico (BCA) (Sigma). L'attività dei complessi I-IV e CS è stata determinata in base a protocolli precedentemente pubblicati [10-11], che sono stati modificati per la misurazione in un lettore di micropiastre (Infinite M200 PRO, Tecan). Tutte le misurazioni sono state effettuate in tetraplicati. Le attività di RC e CS sono state espresse come nmol/min/mg di proteine ​​totali, ad eccezione del complesso IV, che è stato espresso come Δ log (A550)/min/mg di proteine ​​totali. Le attività enzimatiche dei complessi RC sono state anche normalizzate all'attività di CS, che viene utilizzato come indicatore dell'abbondanza di mitocondri all'interno di un tessuto.

Biopsia del tessuto adiposo La biopsia del tessuto adiposo addominale sottocutaneo (SAAT) è stata eseguita in ogni partecipante. L'ago di Bergström è stato utilizzato per ottenere campioni di grasso sottocutaneo dall'area paraombelicale come già descritto [12]. La biopsia è stata eseguita a digiuno. Si ottengono circa 300 mg di peso umido. Il campione è stato immediatamente microdissezionato, pesato, diviso per le rispettive analisi e congelato a scatto in azoto liquido e conservato a -80°C fino alle analisi.

PCR quantitativa in tempo reale (RT-qPCR) L'RNA totale dai tessuti è stato isolato utilizzando il tessuto lipidico e il tessuto fibroso RNeasy Mini Kit (Qiagen). La concentrazione di RNA è stata misurata da Nanodrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, USA). L'RNA è stato trattato con DNAse I (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) per rimuovere qualsiasi DNA genomico contaminante. Il cDNA è stato preparato da 200-600 ng di RNA utilizzando il kit di archiviazione cDNA ad alta capacità (Applied Biosystems, Carlsbad CA, USA). L'equivalente di 5 ng di RNA è stato utilizzato per le reazioni PCR in tempo reale utilizzando il master mix Fast Advanced e il saggio di espressione genica (IRS1, GLUT4, BCKDHA, BCKDHB, ACOX, CPT1b, PLIN1, PLIN2, PLIN5, FASN, SCD1, DGAT2, PPAR-γ ; Biosistemi Applicati). Tutti i campioni sono stati analizzati in duplicato. L'espressione genica dei geni bersaglio è stata normalizzata all'espressione di RPS13 (glucuronidasi, beta) e il cambiamento di piega dell'espressione è stato calcolato utilizzando il metodo delta delta Ct.

Lo spettro degli acidi grassi nell'AT Lo spettro degli acidi grassi nell'AT è stato valutato utilizzando la gascromatografia, un metodo già descritto da Lepage e Roy [13] con le modifiche di Rodriguez-Palmero et al. [14] In breve, il metodo prevede un'estrazione con cloroformio/metanolo di AT liofilizzato per isolare i lipidi e la successiva transesterificazione o esterificazione di FA legata ai lipidi per formare esteri metilici, che sono stati poi analizzati mediante gascromatografia.

Analisi statistica I dati sono presentati in testo, tabelle e figure come medie ± DS con IC 95% e valori p <0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. Il test t di Student è stato utilizzato in campioni osservativi per dati normalmente distribuiti. Il test delle coppie appaiate di Wilcoxon è stato utilizzato quando i dati non erano distribuiti normalmente. I campioni di intervento sono stati confrontati utilizzando un modello lineare generale per testare la significatività statistica delle differenze tra i gruppi. Un modello misto ANOVA è stato utilizzato per valutare l'interazione gruppo × tempo. All'interno di ogni gruppo gli effetti temporali dell'intervento sono stati valutati utilizzando l'ANOVA a misure ripetute con il confronto multiplo di Bonferroni. Dove c'erano solo due set di dati all'interno di ciascun gruppo (ad es. solo i dati di riferimento e di intervento come nei dati ottenuti da biopsie tissutali) sono stati utilizzati t-test accoppiati per dati normalmente distribuiti e test di Wilcoxon quando i dati non erano normalmente distribuiti. Il coefficiente di correlazione di Pearson è stato calcolato per esprimere la relazione tra i cambiamenti dal basale all'intervento per dati normalmente distribuiti e il coefficiente di correlazione di Spearman è stato calcolato quando i dati non erano distribuiti normalmente. Statistica 9.0, StatSoft, Inc. USA è stata utilizzata per eseguire tutte le procedure statistiche.