多発性骨髄腫における免疫療法に対する耐性のゲノムおよび表現型の決定要因

目的 1: BM における細胞固有のメカニズムの評価。

1. 全ゲノム配列決定 (WGS) および全エクソーム配列決定 (WES) は、マーカー CD138+ 精製細胞に対して実行され、そのゲノムプロファイルを評価し、口腔スワブ DNA に対して分析を明確な体細胞状態を有するバリアントまたは構造異常に限定します。したがって、腫瘍細胞に特異的です。 詳細に：

   1.1 WGS: ライブラリーは、500ng のゲノム DNA から TruSeq™(Kit Illumina) DNA Polymerase Chain Reaction (PCR)-Free Library Preparation Kit (Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して、平均 300bp のターゲットインサートを目指して調製されます。 シーケンスは、150bp ペアエンド プロトコルで、腫瘍サンプルの場合は 40x、正常サンプルの場合は 30x のターゲット深度で実行されます。

   1.2 WES: ライブラリーは、100 ng のゲノム DNA から SureSelectXT Human All Exon V6 (Agilent technologies int., Santa Clara, CA) を使用して、平均 300 bp のターゲット インサートを目指して調製されます。 シーケンスは、腫瘍サンプルの場合は 200x、正常サンプルの場合は 100x のターゲット深度を目指して、150bp ペアエンド プロトコルで実行されます。

   1.3 データ分析: 次世代シーケンシング スコアリング システムの出力形式ファイル (*.FASTQ ファイル) は、Burrows-Wheeler Alignment Tool (BWAmem) を使用して参照ゲノムに整列され、重複排除された整列された Binary Alignment Map (BAM) ファイルは、 Wellcome Trust Sanger Institute (WTSI) で入手できる以下の公開ツール:

   1. 正確なゲノム全体の対立遺伝子特異的コピー数 (ASCAT) と、クローンおよびサブクローンのコピー数の変化に関するバッテンバーグ。
   2. BRASS 構造のバリエーション (大きな逆位と欠失、転座、内部タンデム重複)。
   3. 単一ヌクレオチドバリアント (SNV) および小さな挿入欠失 (インデル) の穴居人およびピンデル。

   サンプルのクローン組成と時間の経過に伴う骨髄腫のゲノム進化は、階層的なベイジアン ディリクレ プロセスを使用して特定、クラスター化、分析されたバリアントの調整されたがん細胞分画から推測されます。

   MM のさまざまな段階で機能する変異プロセスは、Non-Negative Matrix Factorization (NNMF) アプローチを使用して分析され、5' および 3' コンテキストで置換の配列から変異シグネチャが抽出されます。

   抽出されたすべてのミスセンス突然変異の可能なドライバー突然変異の役割は、最近公開された dN/dS アルゴリズムによって評価されます。

2. トランスクリプトームプロファイルを評価するためのマーカー CD138+ 精製細胞の RNA-seq は、500 ng の全 RNA で TruSeq Stranded Messanger RiboNucleic Acid (mRNA) Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) を使用して実行され、続いて 100x106 の合計読み取りを目指して配列決定されます。サンプルあたり。 サンプル間の発現レベルの正規化を促進するために、DNA 除去修復タンパク質 (ERCC) スパイクイン ミックスが追加されます。 読み取りは、SNV、インデルを呼び出し、遺伝子融合を検出するために Tophat2 と整列されます。 Cufflinks2 は、遺伝子発現のプロファイルを作成し、新規の転写アイソフォームを検出するために使用されます。 全体的な遺伝子転写産物の発現レベルは、一意にマッピングされた読み取りに基づく 1 キロベース ミリオンあたりの読み取り数 (RPKM) メトリックを使用して定量化されます。
3. フローサイトメトリー分析は、免疫療法の感受性/耐性の潜在的な決定要因と、マーカー クラスター オブ 分化 38 (CD38)、B 細胞成熟抗原 (BCMA)、マーカー クラスター オブ 分化 33 (CD33 )、プログラム死リガンド 1 (PDL1)、および治療前、応答時、および再発時のマーカー クラスター オブ ディファレンシエーション 19 (CD19)。 病気の進行中の抗原発現を監視するために、陽性細胞の MM パーセントと平均蛍光強度 (MFI) を評価します。 受容体密度も実施されます。 さらに、国際骨髄腫財団 (EuroFlow-IMF) MM 微小残存病変 (MRD) パネルの欧州サイトフロー コンソーシアムは、特にマルチエピトープ (ME) 抗 CD38 を使用して耐性の可能性のある決定因子を検出することにより、MRD を監視するために適用されます。 さらに、このパネルにより、特にボルテゾミブに対する耐性のメカニズムとして示唆されている、より未熟な細胞へのシフトを見て、クローン集団の表現型の進化を監視することができます。
4. 実行可能なマーカー CD138- の保存: マーカー CD138- 細胞でもマーカー CD38 の分布を評価し、耐性の原因となるゲノムまたは免疫表現型の病変がマーカー CD138- 画分にも存在する可能性があるかどうかを判断します。

目的 2: BM および PB の細胞外因性メカニズムの評価。

1. リンパ球亜集団のフローサイトメトリー分析は、T細胞集団（マーカーCD38 +、マーカー分化4（CD4 +）、マーカー分化8（CD8 +）、Treg細胞）およびその他の調節および骨髄由来サプレッサー細胞 (MDSC) のような抑制免疫集団。 T細胞はベースライン時、反応時、再発時に測定され、免疫療法を受けている患者のB細胞コンパートメントとT細胞コンパートメント間の相互作用を評価するのに役立ちます. さらに、ベースライン時および治療後の T 細胞に対するいくつかの免疫チェックポイントの評価が行われます。
2. リンパ球亜集団の RNA-seq を実行して、さまざまなヘルパーおよびエフェクターリンパ球集団の頻度を特定し、それらを治療への応答またはその欠如と関連付けます。 また、応答性および非応答性 MM のさまざまなマーカー CD4 + T リンパ球亜集団に対して RNA-seq を実行し、後者のグループの潜在的な抑制シグネチャを特定します。 同じリンパ球亜集団を、10人の健康な被験者からのBMサンプルで分析します（リンパ腫陰性病期におけるBM生検）。
3. BM 微小環境内の MM および他の細胞によって産生および分泌される広範囲のサイトカインの測定: MM 骨および微小環境に関連するサイトカインおよびケモカインは、各時点で患者からの BM および PB 血漿で測定されます。 ラボアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）キットを使用して実行されます。
4. BM生検：ベースライン時およびモノクローナル抗体療法（mAbs療法）後のMM患者からの骨生検は、マーカーCluster of Differentiation 80/86（CD80/86）、マーカーCluster of Differentiation 40などの抑制分子の発現について評価されます（ CD40) は、免疫組織化学による腫瘍細胞および BM リンパ球集団で検出されます。

目的 3: CD138 + 細胞のゲノム、トランスクリプトーム、および免疫表現型の特徴を包括的に特徴付け、MM におけるエフェクター/抑制免疫集団の明確な画像を取得した後、これらの特徴を臨床データと関連付けます。 詳細には、次の列を含むデータベースを作成します。

• ベースラインの臨床的特徴
• 予後因子：国際病期分類システム（ISS）、改訂国際病期分類システム（R-ISS）、乳酸脱水素酵素（LDH）、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション検査（FISH）による細胞遺伝学的分析
• 以前の治療法と関連する臨床結果
• 最良の応答: 応答は、国際統一応答基準に従って定義されます。 応答者は、少なくとも VGPR を持つ被験者として定義されます。
• 奏効期間（DOR）、無増悪生存期間（PFS）、全生存期間（OS）、進行までの時間（TTP）のデータ-内因性および細胞外因性の特徴は、応答のより良い予測因子です。 疾患の反応を評価できるようになるまでには時間がかかるため、この分析は少なくとも 1 年間の治療後、または進行が早い段階で実施されます。 最初の分析では、生物学的特徴は、線形モデルを使用して、治療、PFS、およびその他のベースラインの臨床、予後、および治療変数に対する最良の反応と関連付けられます。 その後、十分なフォローアップによって PFS と OS の有意義な分析が可能になる 3 年目から、Kaplan-Meier モデルと Coxregression モデルを適合させて、独立した予後因子の可能性を特定します。

コホートのサイズが比較的小さいため、統計的検出力とサブグループ分析を実行する可能性が制限されますが、バイオマーカーを特定するこの試みは、MM での膨大な数の救済治療を優先し、コストを削減することにより、患者の臨床管理を改善する可能性があります。