Genomiske og fenotypiske determinanter for motstand mot immunterapi ved multippelt myelom

Mål 1: Evaluering av celle-intrinsiske mekanismer på BM.

1. Whole Genome Sequencing (WGS) og Whole Exome Sequencing (WES) vil bli utført på markør CD138+ rensede celler for å evaluere deres genomiske profil, og på bukkal vattpinne DNA for å begrense analysen til varianter eller strukturelle abnormiteter som har en klar somatisk status, og er derfor spesifikt for tumorcellene. I detaljer:

   1.1 WGS: biblioteker vil bli klargjort med TruSeq™(Kit Illumina) DNA Polymerase Chain Reaction (PCR)-fritt biblioteksforberedelsesett (Illumina, San Diego, CA) fra 500 ng genomisk DNA, med sikte på en gjennomsnittlig målinnsetting på 300bp. Sekvensering vil bli utført på en 150bp-paret endeprotokoll, ved en måldybde på 40x for tumorprøver og 30x for normale prøver.

   1.2 WES: biblioteker vil bli forberedt med SureSelectXT Human All Exon V6 (Agilent technologies int., Santa Clara, CA) fra 100 ng genomisk DNA, med sikte på en gjennomsnittlig målinnsetting på 300 bp. Sekvensering vil bli utført på en 150bp-paret endeprotokoll, med sikte på en måldybde på 200x for tumorprøver og 100x for normale prøver.

   1.3 Dataanalyse: neste generasjons utdataformatfiler for sekvensering av scoringssystem (*.FASTQ-filer) vil bli justert til referansegenomet ved hjelp av Burrows-Wheeler Alignment Tool (BWAmem), og dedupliserte justerte Binary Alignment Map-filer (BAM) vil bli analysert ved hjelp av følgende publiserte verktøy tilgjengelig på Wellcome Trust Sanger Institute (WTSI):

   1. nøyaktig genomomfattende allel-spesifikt kopinummer (ASCAT) og Battenberg for klonale og subklonale kopinummerendringer.
   2. MESSING for strukturelle variasjoner (store inversjoner og slettinger, translokasjoner, intern tandem duplisering).
   3. Caveman og Pindel for Single Nucleotide Variants (SNVs) og små insersjon-delesjoner (indels).

   Den klonale sammensetningen av prøven og den genomiske utviklingen av myelom over tid vil bli utledet fra den justerte kreftcellefraksjonen av variantene som er identifisert, gruppert og analysert ved hjelp av en hierarkisk bayesiansk Dirichlet-prosess.

   Mutasjonsprosessene som opererer i ulike faser av MM vil bli analysert ved å bruke en ikke-negativ matrisefaktorisering (NNMF) tilnærming for å trekke ut mutasjonssignaturer fra utvalget av substitusjoner i deres 5'- og 3'-kontekst.

   Den mulige drivermutasjonsrollen til all ekstrahert missense-mutasjon vil bli evaluert av den nylig publiserte dN/dS-algoritmen.

2. RNA-seq på markør CD138+ rensede celler for å evaluere transkriptomisk profil vil bli utført ved bruk av TruSeq Stranded Messanger RiboNucleic Acid (mRNA) Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) på 500 ng totalt RNA, etterfulgt av sekvensering, med sikte på totalt 100x106 avlesninger per prøve. DNA excision repair protein (ERCC) spike-in mix vil bli tilsatt for å lette normalisering av ekspresjonsnivåene mellom prøvene. Leser vil bli justert med Tophat2 for å kalle SNVs, indels og oppdage genfusjoner. Cufflinks2 vil bli brukt til å profilere genuttrykk og oppdage nye transkriptisoformer. Overordnede gentranskripsjonsuttrykksnivåer vil kvantifiseres ved å bruke Reads Per Kilobase Million (RPKM)-metrikken basert på unikt kartleggingsavlesninger.
3. Flowcytometrianalyse vil bli utført på BM-prøver for å undersøke potensielle determinanter for immunterapisensitivitet/resistens og uttrykket av spesifikke mål, inkludert markør Cluster of Differentiation 38 (CD38), B-celle modningsantigen (BCMA), markør Cluster of Differentiation 33 (CD33) ), Programmert dødsligand 1 (PDL1) og markør Cluster of Differentiation 19 (CD19) før behandling, ved respons og ved tilbakefall. Vi vil evaluere MM prosent positive celler og gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) for å overvåke antigenekspresjonen under utviklingen av sykdommen. Reseptortetthet vil også bli utført. Dessuten vil det europeiske cytoflow-konsortiet til International Myeloma Foundation (EuroFlow-IMF) MM minimal residual disease (MRD) panel bli brukt for å overvåke MRD spesielt ved å bruke en multiepitop (ME) antiCD38 for å oppdage mulige determinanter for resistens. Dessuten vil dette panelet tillate oss å overvåke fenotypeutviklingen til den klonale populasjonen, og se spesielt på skiftet mot mer umodne celler, som har blitt foreslått som en mekanisme for resistens mot bortezomib.
4. Lagring av levedyktig markør CD138-: vi vil evaluere distribusjon av markør CD38 også på markør CD138-celler og vi vil bestemme om genomiske eller immunfenotypiske lesjoner ansvarlige for resistens kan være tilstede også i markør CD138-fraksjonen.

Mål 2: Evaluering av celleekstrinsisk mekanisme på BM og PB.

1. Flowcytometrianalyse av lymfocyttsubpopulasjoner vil bli utført i samme BM og PB for å evaluere T-cellepopulasjonen (markør CD38+, markør Cluster of Differentiation 4 (CD4+), markør Cluster of Differentiation 8 (CD8+), Tregs-celler) og andre regulatoriske og undertrykkende immunpopulasjoner som Myeloid-Derived Suppressor Cells (MDSCs). T-celler vil bli målt ved baseline, respons og ved tilbakefall, og de kan hjelpe til med å evaluere interaksjonen mellom B- og T-celle-rom hos pasienter som får immunterapi. I tillegg vil det bli utført evaluering av noen immunkontrollpunkter på T-celler ved baseline og etterbehandling.
2. RNA-seq av lymfocyttsubpopulasjoner vil bli utført for å identifisere frekvensene til de forskjellige hjelper- og effektorlymfocyttpopulasjonene, og korrelere de med respons på behandling eller mangel på den. Vi vil også utføre RNA-seq på forskjellige markør CD4+ T-lymfocytiske subpopulasjoner i responsiv og ikke-responsiv MM for å identifisere potensielle undertrykkende signaturer i sistnevnte gruppe. De samme lymfocyttsubpopulasjonene vil bli analysert i BM-prøver fra 10 friske forsøkspersoner (BM-biopsi i lymfomnegativ stadieinndeling).
3. Måling av et bredt spekter av cytokiner produsert og utskilt av MM og andre celler i BM-mikromiljøet: cytokiner og kjemokiner relatert til MM-ben og mikromiljø vil bli målt i BM- og PB-plasma fra pasienter på hvert tidspunkt. Laboratorieanalysene vil bli utført ved å bruke et enzym-koblet immunosorbent assay (ELISA) kit.
4. BM-biopsi: beinbiopsier fra MM-pasienter ved baseline og etter monoklonal antistoffterapi (mAbs-terapi) vil bli evaluert for ekspresjon av suppressive molekyler som markør Cluster of Differentiation 80/86 (CD80/86), markør Cluster of Differentiation 40 ( CD40) i tumorcellene og i BM-lymfoidpopulasjonen ved immunhistokjemi.

Mål 3: Etter omfattende karakterisering av de genomiske, transkriptomiske og immunfenotypiske egenskapene til CD138+-celler, og etter å ha et klart bilde av effektor/suppressiv immunpopulasjon i MM, vil vi deretter korrelere disse trekkene med kliniske data. I detalj vil vi lage en database med følgende kolonner:

• Baseline kliniske egenskaper
• Prognostiske faktorer: International Staging System (ISS), Revided International Staging System (R-ISS), Lactate Dehydrogenase (LDH), cytogenetisk analyse ved Fluorescence In Situ Hybridization Test (FISH)
• Tidligere terapier og relevante kliniske resultater
• Beste svar: svar vil bli definert i henhold til International Uniform Response Criteria. Responders er definert som personer med minst en VGPR.
• Varighet av respons (DOR), Progresjonsfri overlevelse (PFS), Total overlevelse (OS) og Tid til Progresjon (TTP) data I dette målet vil vi se etter korrelasjon mellom biologiske egenskaper og sykdomsrespons eller mangel på dette, for å forstå hvilken celle -Indre og celleekstrinsiske egenskaper er bedre prediktorer for respons. På grunn av tiden som trengs før sykdomsrespons kan vurderes, vil denne analysen utføres etter minst 1 års behandling eller ved tidligere progresjon. I en første analyse vil biologiske trekk være assosiert med best respons på behandling, PFS og andre baseline kliniske, prognostiske og behandlingsvariabler ved bruk av lineære modeller. Deretter, fra og med år 3, når nok oppfølging vil tillate en meningsfull analyse av PFS og OS, vil Kaplan-Meier og Coxregresjonsmodeller bli tilpasset for å identifisere mulige uavhengige prognostiske faktorer.

Selv om den relativt lille størrelsen på kohorten vil begrense statistisk kraft og muligheten til å utføre undergruppeanalyse, kan dette forsøket på å identifisere biomarkører forbedre den kliniske behandlingen av pasienten, ved å prioritere det store utvalget av bergingsbehandlinger i MM og dermed redusere kostnadene.