Genomowe i fenotypowe uwarunkowania oporności na immunoterapie w szpiczaku mnogim

Cel 1: Ocena wewnętrznych mechanizmów komórkowych na BM.

1. Sekwencjonowanie całego genomu (WGS) i sekwencjonowanie całego egzomu (WES) zostanie przeprowadzone na komórkach oczyszczonych z markera CD138+ w celu oceny ich profilu genomowego oraz na DNA wymazu z policzka w celu ograniczenia analizy do wariantów lub nieprawidłowości strukturalnych, które mają wyraźny status somatyczny i są dlatego specyficzne dla komórek nowotworowych. W szczegółach:

   1.1 WGS: biblioteki zostaną przygotowane przy użyciu TruSeq™ (Kit Illumina) DNA Polymerase Chain Reaction (PCR)-Free Library Preparation Kit (Illumina, San Diego, CA) z 500 ng genomowego DNA, dążąc do uzyskania wstawki o średniej wielkości 300 bp. Sekwencjonowanie zostanie przeprowadzone zgodnie z protokołem parowania końców o długości 150 pz, na docelowej głębokości 40x dla próbek guza i 30x dla próbek prawidłowych.

   1.2 WES: biblioteki zostaną przygotowane przy użyciu SureSelectXT Human All Exon V6 (Agilent Technologies int., Santa Clara, CA) ze 100 ng genomowego DNA, dążąc do uzyskania średniej docelowej wstawki o wielkości 300 bp. Sekwencjonowanie zostanie przeprowadzone zgodnie z protokołem końcowym sparowanym 150 bp, dążąc do docelowej głębokości 200x dla próbek guza i 100x dla normalnych próbek.

   1.3 Analiza danych: pliki formatu wyjściowego systemu oceniania sekwencjonowania nowej generacji (pliki *.FASTQ) zostaną dopasowane do genomu referencyjnego za pomocą narzędzia Burrows-Wheeler Alignment Tool (BWAmem), a wyrównane po deduplikacji pliki Binary Alignment Map (BAM) zostaną przeanalizowane przy użyciu następujące opublikowane narzędzia dostępne w Wellcome Trust Sanger Institute (WTSI):

   1. dokładna liczba kopii specyficznych dla alleli całego genomu (ASCAT) i Battenberg dla klonalnych i subklonalnych zmian liczby kopii.
   2. BRASS dla zmian strukturalnych (duże inwersje i delecje, translokacje, wewnętrzna duplikacja tandemowa).
   3. Caveman i Pindel dla wariantów pojedynczych nukleotydów (SNV) i małych delecji insercyjnych (indele).

   Klonalny skład próbki i ewolucja genomowa szpiczaka w czasie zostaną wywnioskowane z dostosowanej frakcji komórek nowotworowych zidentyfikowanych, pogrupowanych i przeanalizowanych przy użyciu hierarchicznego procesu bayesowskiego Dirichleta.

   Procesy mutacyjne działające w różnych fazach MM zostaną przeanalizowane przy użyciu metody nieujemnej faktoryzacji macierzy (NNMF) w celu wyodrębnienia sygnatur mutacji z szeregu podstawień w ich kontekście 5' i 3'.

   Możliwa rola mutacji kierowcy we wszystkich wyodrębnionych mutacjach zmiany sensu zostanie oceniona za pomocą niedawno opublikowanego algorytmu dN / dS.

2. Sekwencja RNA na komórkach oczyszczonych z markera CD138+ w celu oceny profilu transkryptomicznego zostanie przeprowadzona przy użyciu zestawu TruSeq Stranded Messanger RiboNucleic Acid (mRNA) Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) na 500 ng całkowitego RNA, a następnie sekwencjonowanie, dążąc do całkowitych odczytów 100x106 na próbkę. Mieszanka wzbogacona białkiem naprawy wycinania DNA (ERCC) zostanie dodana w celu ułatwienia normalizacji poziomów ekspresji między próbkami. Odczyty zostaną wyrównane z Tophat2, aby wywoływać SNV, indele i wykrywać fuzje genów. Spinki do mankietów2 zostaną wykorzystane do profilowania ekspresji genów i wykrywania nowych izoform transkryptu. Ogólne poziomy ekspresji transkryptu genów zostaną określone ilościowo przy użyciu metryki odczytów na milion baz danych (RPKM) w oparciu o unikalne odczyty mapowania.
3. Analiza metodą cytometrii przepływowej zostanie przeprowadzona na próbkach BM w celu zbadania potencjalnych determinantów wrażliwości/oporności na immunoterapię oraz ekspresji specyficznych celów, w tym markera Cluster of Differentiation 38 (CD38), antygenu dojrzewania komórek B (BCMA), markera Cluster of Differentiation 33 (CD33 ), Ligand zaprogramowanej śmierci 1 (PDL1) i marker Cluster of Differentiation 19 (CD19) przed leczeniem, w odpowiedzi i przy nawrocie. Ocenimy procent komórek MM dodatnich i średnią intensywność fluorescencji (MFI) w celu monitorowania ekspresji antygenu podczas ewolucji choroby. Zostanie również przeprowadzona gęstość receptorów. Ponadto europejskie konsorcjum cytoflow Międzynarodowej Fundacji Szpiczaka (EuroFlow-IMF) panel minimalnej choroby resztkowej (MRD) MM zostanie wykorzystane do monitorowania MRD, w szczególności za pomocą wieloepitopowego (ME) antyCD38 do wykrywania możliwych determinantów oporności. Ponadto ten panel pozwoli nam monitorować ewolucję fenotypu populacji klonalnej, patrząc w szczególności na przesunięcie w kierunku bardziej niedojrzałych komórek, co sugerowano jako mechanizm oporności na bortezomib.
4. Przechowywanie żywotnego markera CD138-: ocenimy rozmieszczenie markera CD38 również na komórkach markerowych CD138- i ustalimy, czy zmiany genomowe lub immunofenotypowe odpowiedzialne za oporność mogą być obecne również we frakcji markerowej CD138-.

Cel 2: Ocena zewnętrznego mechanizmu komórkowego na BM i PB.

1. Analiza cytometrii przepływowej subpopulacji limfocytów zostanie przeprowadzona w tym samym BM i PB w celu oceny populacji limfocytów T (marker CD38+, marker Cluster of Differentiation 4 (CD4+), marker Cluster of Differentiation 8 (CD8+), komórki Tregs) i inne supresyjne populacje odpornościowe, takie jak komórki supresorowe pochodzenia mieloidalnego (MDSC). Limfocyty T będą mierzone na początku badania, w odpowiedzi i przy nawrocie choroby, co może pomóc w ocenie interakcji między przedziałami limfocytów B i T u pacjentów poddawanych immunoterapii. Ponadto zostanie przeprowadzona ocena niektórych immunologicznych punktów kontrolnych na limfocytach T na początku leczenia i po leczeniu.
2. Sekwencja RNA subpopulacji limfocytów zostanie przeprowadzona w celu zidentyfikowania częstości występowania różnych populacji limfocytów pomocniczych i efektorowych oraz skorelowania ich z odpowiedzią na leczenie lub jego brakiem. Przeprowadzimy również RNA-seq na różnych markerowych subpopulacjach limfocytów T CD4 + w reagującym i niereagującym MM, aby zidentyfikować potencjalne sygnatury supresyjne w tej drugiej grupie. Te same subpopulacje limfocytów będą analizowane w próbkach BM od 10 zdrowych osobników (biopsja BM w stadium negatywnym dla chłoniaka).
3. Pomiar szerokiego spektrum cytokin wytwarzanych i wydzielanych przez szpiczaka mnogiego i inne komórki w mikrośrodowisku szpiczaka mnogiego: cytokiny i chemokiny związane z kością i mikrośrodowiskiem szpiczaka mnogiego będą mierzone w osoczu BM i PB pacjentów w każdym punkcie czasowym. Testy laboratoryjne zostaną przeprowadzone przy użyciu zestawu do testu immunoenzymatycznego (ELISA).
4. Biopsja szpiczaka mnogiego: biopsje kości pacjentów ze szpiczakiem mnogim na początku badania i po terapii przeciwciałami monoklonalnymi (mAbs) będą oceniane pod kątem ekspresji cząsteczek hamujących, takich jak marker Cluster of Differentiation 80/86 (CD80/86), marker Cluster of Differentiation 40 ( CD40) w komórkach nowotworowych iw populacji limfoidalnej BM za pomocą immunohistochemii.

Cel 3: Po kompleksowym scharakteryzowaniu cech genomowych, transkryptomicznych i immunofenotypowych komórek CD138+ oraz uzyskaniu jasnego obrazu efektorowej/supresyjnej populacji immunologicznej w MM, skorelujemy te cechy z danymi klinicznymi. Szczegółowo utworzymy bazę danych zawierającą następujące kolumny:

• Wyjściowa charakterystyka kliniczna
• Czynniki prognostyczne: International Staging System (ISS), Revised International Staging System (R-ISS), dehydrogenaza mleczanowa (LDH), analiza cytogenetyczna za pomocą testu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH)
• Wcześniejsze terapie i istotne wyniki kliniczne
• Najlepsza odpowiedź: odpowiedzi zostaną określone zgodnie z Międzynarodowymi Jednolitymi Kryteriami Odpowiedzi. Respondenci są definiowani jako osoby z co najmniej VGPR.
• Dane dotyczące czasu trwania odpowiedzi (DOR), przeżycia wolnego od progresji choroby (PFS), przeżycia całkowitego (OS) i czasu do progresji choroby (TTP) W tym celu będziemy szukać korelacji między cechami biologicznymi a odpowiedzią na chorobę lub jej brakiem, aby zrozumieć, która komórka - cechy wewnętrzne i zewnętrzne komórki są lepszymi predyktorami odpowiedzi. Ze względu na czas potrzebny do oceny odpowiedzi choroby analiza ta zostanie przeprowadzona po co najmniej 1 roku leczenia lub przy wcześniejszej progresji. W pierwszej analizie cechy biologiczne zostaną powiązane z najlepszą odpowiedzią na leczenie, PFS i innymi wyjściowymi zmiennymi klinicznymi, prognostycznymi i terapeutycznymi przy użyciu modeli liniowych. Następnie, począwszy od roku 3, kiedy wystarczająca liczba obserwacji pozwoli na miarodajną analizę PFS i OS, zostaną dopasowane modele Kaplana-Meiera i Coxregresji w celu zidentyfikowania możliwych niezależnych czynników prognostycznych.

Chociaż stosunkowo mały rozmiar kohorty ograniczy moc statystyczną i możliwość przeprowadzenia analizy podgrup, ta próba identyfikacji biomarkerów może poprawić postępowanie kliniczne z pacjentem, nadając priorytet szerokiej gamie zabiegów ratunkowych w MM, a tym samym zmniejszając koszty.