Determinanti genomici e fenotipici della resistenza alle immunoterapie nel mieloma multiplo

Obiettivo 1: Valutazione dei meccanismi intrinseci cellulari sulla BM.

1. Il Whole Genome Sequencing (WGS) e il Whole Exome Sequencing (WES) saranno eseguiti su cellule purificate marcatore CD138+ per valutare il loro profilo genomico, e sul DNA di tampone buccale per restringere l'analisi a varianti o anomalie strutturali che hanno un chiaro stato somatico, e sono quindi specifico per le cellule tumorali. Nei dettagli:

   1.1 WGS: le librerie saranno preparate con TruSeq™(Kit Illumina) DNA Polymerase Chain Reaction (PCR)-Free Library Preparation Kit (Illumina, San Diego, CA) da 500 ng di DNA genomico, mirando a un inserto target medio di 300 bp. Il sequenziamento sarà eseguito su un protocollo finale accoppiato di 150 bp, a una profondità target di 40x per i campioni tumorali e 30x per i campioni normali.

   1.2 WES: le librerie saranno preparate con SureSelectXT Human All Exon V6 (Agilent technologies int., Santa Clara, CA) da 100 ng di DNA genomico, mirando a un inserto target medio di 300 bp. Il sequenziamento verrà eseguito su un protocollo finale accoppiato a 150 bp, mirando a una profondità target di 200x per i campioni tumorali e 100x per i campioni normali.

   1.3 Analisi dei dati: i file in formato di output del sistema di punteggio del sequenziamento di nuova generazione (file *.FASTQ) saranno allineati al genoma di riferimento utilizzando Burrows-Wheeler Alignment Tool (BWAmem) e i file BAM (Binary Alignment Map) allineati deduplicati saranno analizzati utilizzando il seguenti strumenti pubblicati disponibili presso il Wellcome Trust Sanger Institute (WTSI):

   1. accurato numero di copie allele-specifico dell'intero genoma (ASCAT) e Battenberg per le modifiche del numero di copie clonali e subclonali.
   2. BRASS per variazioni strutturali (grandi inversioni e delezioni, traslocazioni, duplicazioni tandem interne).
   3. Caveman e Pindel per varianti a singolo nucleotide (SNV) e piccole delezioni di inserzione (indel).

   La composizione clonale del campione e l'evoluzione genomica del mieloma nel tempo saranno dedotte dalla frazione di cellule tumorali aggiustate delle varianti identificate, raggruppate e analizzate utilizzando un processo Dirichlet bayesiano gerarchico.

   I processi mutazionali operativi nelle varie fasi del MM saranno analizzati utilizzando un approccio di fattorizzazione di matrice non negativa (NNMF) per estrarre le firme mutazionali dall'array di sostituzioni nel loro contesto 5' e 3'.

   Il possibile ruolo della mutazione driver di tutte le mutazioni missenso estratte sarà valutato dall'algoritmo dN/dS recentemente pubblicato.

2. L'RNA-seq su cellule purificate marcatore CD138+ per valutare il profilo trascrittomico verrà eseguito utilizzando il kit di preparazione della libreria TruSeq Stranded Messanger RiboNucleic Acid (mRNA) (Illumina, San Diego, CA) su 500 ng di RNA totale, seguito dal sequenziamento, puntando a 100x106 letture totali per campione. Verrà aggiunta una miscela di spike-in della proteina di riparazione dell'escissione del DNA (ERCC) per facilitare la normalizzazione dei livelli di espressione tra i campioni. Le letture saranno allineate con Tophat2 per chiamare SNV, indel e rilevare fusioni geniche. Gemelli2 saranno utilizzati per profilare l'espressione genica e rilevare nuove isoforme di trascritto. I livelli complessivi di espressione del trascritto genico saranno quantificati utilizzando la metrica Reads Per Kilobase Million (RPKM) basata su letture di mappatura univoche.
3. L'analisi della citometria a flusso sarà eseguita su campioni di midollo osseo per esaminare i potenziali determinanti della sensibilità/resistenza all'immunoterapia e l'espressione di bersagli specifici tra cui il marker Cluster of Differentiation 38 (CD38), l'antigene di maturazione delle cellule B (BCMA), il marker Cluster of Differentiation 33 (CD33 ), ligando della morte programmata 1 (PDL1) e marcatore Cluster of Differentiation 19 (CD19) prima del trattamento, alla risposta e alla ricaduta. Valuteremo la percentuale di cellule MM positive e l'intensità media di fluorescenza (MFI) per monitorare l'espressione dell'antigene durante l'evoluzione della malattia. Verrà eseguita anche la densità del recettore. Inoltre, il pannello MM della malattia minima residua (MRD) MM sarà utilizzato dal consorzio europeo cytoflow della International Myeloma Foundation (EuroFlow-IMF) per monitorare la MRD in particolare utilizzando un multiepitopo (ME) antiCD38 per rilevare possibili determinanti di resistenza. Inoltre questo pannello ci permetterà di monitorare l'evoluzione fenotipica della popolazione clonale, osservando in particolare lo spostamento verso cellule più immature, che è stato ipotizzato come meccanismo di resistenza al bortezomib.
4. Conservazione del marcatore vitale CD138-: valuteremo la distribuzione del marcatore CD38 anche sulle cellule marcatori CD138- e determineremo se lesioni genomiche o immunofenotipiche responsabili della resistenza possano essere presenti anche nella frazione del marcatore CD138-.

Obiettivo 2: Valutazione del meccanismo estrinseco cellulare su BM e PB.

1. L'analisi di citometria a flusso delle sottopopolazioni di linfociti sarà eseguita nello stesso BM e PB per valutare la popolazione di cellule T (marker CD38+, marker Cluster of Differentiation 4 (CD4+), marker Cluster of Differentiation 8 (CD8+), Tregs cells) e altre cellule regolatorie e popolazioni immunitarie soppressive come le cellule soppressori derivate da mieloidi (MDSC). Le cellule T saranno misurate al basale, alla risposta e alla ricaduta e potrebbero aiutare a valutare l'interazione tra i compartimenti delle cellule B e T nei pazienti che ricevono immunoterapie. Inoltre, verrà eseguita la valutazione di alcuni checkpoint immunitari sulle cellule T al basale e dopo il trattamento.
2. L'RNA-seq delle sottopopolazioni linfocitarie sarà eseguito per identificare le frequenze delle varie popolazioni linfocitarie helper ed effettrici, e correlare quelle con la risposta al trattamento o la sua mancanza. Effettueremo anche RNA-seq su diverse sottopopolazioni di linfociti T CD4+ marcatori in MM responsivo e non responsivo per identificare potenziali firme soppressive in quest'ultimo gruppo. Le stesse sottopopolazioni linfocitarie saranno analizzate in campioni di BM prelevati da 10 soggetti sani (biopsia BM in stadiazione linfoma negativa).
3. Misurazione di un ampio spettro di citochine prodotte e secrete dal MM e da altre cellule all'interno del microambiente del midollo osseo: le citochine e le chemochine correlate all'osso e al microambiente del MM saranno misurate nel plasma del midollo osseo e del PB dei pazienti in ciascun punto temporale. I saggi di laboratorio saranno eseguiti utilizzando un kit ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
4. Biopsia BM: le biopsie ossee di pazienti affetti da MM al basale e dopo la terapia con anticorpi monoclonali (terapia con mAbs) saranno valutate per l'espressione di molecole soppressive come il marker Cluster of Differentiation 80/86 (CD80/86), il marker Cluster of Differentiation 40 ( CD40) nelle cellule tumorali e nella popolazione linfoide BM mediante immunoistochimica.

Obiettivo 3: Dopo aver caratterizzato in modo completo le caratteristiche genomiche, trascrittomiche e immunofenotipiche delle cellule CD138+, e dopo aver ottenuto un quadro chiaro della popolazione immunitaria effettrice/soppressiva nel MM, correleremo queste caratteristiche con i dati clinici. In dettaglio, creeremo un database comprendente le seguenti colonne:

• Caratteristiche cliniche di base
• Fattori prognostici: International Staging System (ISS), Revised International Staging System (R-ISS), Lattato Deidrogenasi (LDH), analisi citogenetica mediante Fluorescence In Situ Hybridization test (FISH)
• Terapie precedenti e risultati clinici rilevanti
• Migliore risposta: le risposte saranno definite in base agli International Uniform Response Criteria. I responder sono definiti come soggetti con almeno un VGPR.
• Dati sulla durata della risposta (DOR), sulla sopravvivenza libera da progressione (PFS), sulla sopravvivenza globale (OS) e sul tempo alla progressione (TTP) -le caratteristiche intrinseche ed estrinseche della cellula sono migliori predittori di risposta. A causa del tempo necessario prima che la risposta alla malattia possa essere valutata, questa analisi verrà eseguita dopo almeno 1 anno di trattamento o in caso di progressione precedente. In una prima analisi, le caratteristiche biologiche saranno associate alla migliore risposta al trattamento, alla PFS e ad altre variabili cliniche, prognostiche e terapeutiche basali utilizzando modelli lineari. Successivamente, a partire dall'anno 3, quando un follow-up sufficiente consentirà un'analisi significativa di PFS e OS, verranno adattati i modelli di regressione di Kaplan-Meier e Cox per identificare possibili fattori prognostici indipendenti.

Sebbene le dimensioni relativamente ridotte della coorte limiteranno il potere statistico e la possibilità di eseguire analisi di sottogruppi, questo tentativo di identificare i biomarcatori potrebbe migliorare la gestione clinica del paziente, dando la priorità alla vasta gamma di trattamenti di salvataggio nel MM e riducendo così i costi.