Геномные и фенотипические детерминанты резистентности к иммунотерапии при множественной миеломе

Цель 1: Оценка внутриклеточных механизмов BM.

1. Полногеномное секвенирование (WGS) и полноэкзомное секвенирование (WES) будут выполняться на клетках, очищенных от маркера CD138+, для оценки их геномного профиля, а также на ДНК буккального мазка, чтобы ограничить анализ вариантами или структурными аномалиями, которые имеют явный соматический статус и являются следовательно, специфичны для опухолевых клеток. Подробно:

   1.1 WGS: библиотеки будут подготовлены с использованием набора TruSeq™ (Kit Illumina) для ДНК-полимеразной цепной реакции (ПЦР) без использования набора для подготовки библиотек (Illumina, Сан-Диего, Калифорния) из 500 нг геномной ДНК с целью получения средней целевой вставки размером 300 п.н. Секвенирование будет выполняться по протоколу с парой концов 150 п.н. с целевой глубиной 40x для образцов опухоли и 30x для нормальных образцов.

   1.2 WES: библиотеки будут подготовлены с помощью SureSelectXT Human All Exon V6 (Agilent Technologies int., Санта-Клара, Калифорния) из 100 нг геномной ДНК, стремясь к средней целевой вставке 300 п.н. Секвенирование будет выполняться по протоколу с парой концов 150 п.н. с целью достижения целевой глубины 200x для образцов опухолей и 100x для нормальных образцов.

   1.3 Анализ данных: файлы выходного формата системы оценки секвенирования нового поколения (файлы *.FASTQ) будут сопоставлены с эталонным геномом с помощью инструмента выравнивания Берроуза-Уилера (BWAmem), а дедуплицированные выровненные файлы Binary Alignment Map (BAM) будут проанализированы с использованием следующие опубликованные инструменты, доступные в Wellcome Trust Sanger Institute (WTSI):

   1. точный аллель-специфический номер копии для всего генома (ASCAT) и метод Баттенберга для изменения числа копий клонов и субклонов.
   2. BRASS для структурных вариаций (большие инверсии и делеции, транслокации, внутренние тандемные дупликации).
   3. Кейвман и Пиндель для однонуклеотидных вариантов (SNV) и небольших вставок-делеций (инделей).

   Клональный состав образца и геномная эволюция миеломы с течением времени будут выведены из скорректированной фракции раковых клеток вариантов, идентифицированных, сгруппированных и проанализированных с использованием иерархического байесовского процесса Дирихле.

   Мутационные процессы, действующие на различных фазах ММ, будут проанализированы с использованием подхода неотрицательной матричной факторизации (NNMF) для извлечения мутационных сигнатур из массива замен в их 5'- и 3'-контексте.

   Возможная роль драйверной мутации для всех извлеченных миссенс-мутаций будет оцениваться с помощью недавно опубликованного алгоритма dN/dS.

2. Секвенирование РНК на клетках, очищенных от маркера CD138+, для оценки транскриптомного профиля будет выполняться с использованием набора TruSeq Stranded Messanger RiboNucleic Acid (mRNA) Library Prep Kit (Illumina, Сан-Диего, Калифорния) на 500 нг общей РНК с последующим секвенированием, направленным на общее количество прочтений 100x106. за образец. Будет добавлена ​​смесь белка эксцизионной репарации ДНК (ERCC), чтобы облегчить нормализацию уровней экспрессии между образцами. Чтения будут согласованы с Tophat2 для вызова SNV, вставок и обнаружения слияния генов. Cufflinks2 будет использоваться для профилирования экспрессии генов и обнаружения новых изоформ транскриптов. Общие уровни экспрессии генных транскриптов будут количественно определены с использованием метрики Reads Per Kilobase Million (RPKM), основанной на уникальном сопоставлении прочтений.
3. Проточная цитометрия будет проводиться на образцах костного мозга для изучения потенциальных детерминант чувствительности/резистентности к иммунотерапии и экспрессии специфических мишеней, включая маркер кластера дифференцировки 38 (CD38), антиген созревания В-клеток (BCMA), маркер кластера дифференцировки 33 (CD33). ), лиганд запрограммированной смерти 1 (PDL1) и маркер кластера дифференцировки 19 (CD19) до лечения, при ответе и при рецидиве. Мы оценим процент положительных клеток MM и среднюю интенсивность флуоресценции (MFI), чтобы контролировать экспрессию антигена во время развития заболевания. Плотность рецепторов также будет выполнена. Кроме того, европейский консорциум цитопотоков Международного фонда миеломы (EuroFlow-IMF) MM панель минимальной остаточной болезни (MRD) будет применяться для мониторинга MRD, в частности, с использованием мультиэпитопного (ME) анти-CD38 для выявления возможных детерминант резистентности. Кроме того, эта панель позволит нам отслеживать эволюцию фенотипа клональной популяции, в частности, обращая внимание на сдвиг в сторону более незрелых клеток, что было предложено в качестве механизма устойчивости к бортезомибу.
4. Хранение жизнеспособного маркера CD138-: мы оценим распределение маркера CD38 также на маркерных клетках CD138- и определим, могут ли геномные или иммунофенотипические поражения, ответственные за резистентность, присутствовать также во фракции маркера CD138-.

Цель 2: Оценка клеточно-внешнего механизма на BM и PB.

1. Анализ субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитометрии будет выполняться в тех же БМ и ПБ для оценки популяции Т-клеток (маркер CD38+, маркер кластера дифференцировки 4 (CD4+), маркер кластера дифференцировки 8 (CD8+), клетки Treg) и других регуляторных и подавляющие иммунные популяции, такие как клетки-супрессоры миелоидного происхождения (MDSC). Т-клетки будут измеряться на исходном уровне, в ответ и при рецидиве, и они могут помочь в оценке взаимодействия между компартментами В- и Т-клеток у пациентов, получающих иммунотерапию. Кроме того, будет проведена оценка некоторых иммунных контрольных точек на Т-клетках на исходном уровне и после лечения.
2. РНК-секвенирование субпопуляций лимфоцитов будет выполняться для определения частот различных популяций хелперных и эффекторных лимфоцитов и корреляции их с ответом на лечение или его отсутствием. Мы также проведем РНК-секвенирование субпопуляций Т-лимфоцитов с различными маркерами CD4+ в реагирующих и не реагирующих ММ, чтобы выявить потенциальные супрессивные сигнатуры в последней группе. Те же самые субпопуляции лимфоцитов будут проанализированы в образцах костного мозга от 10 здоровых субъектов (биопсия костного мозга при отрицательной стадии лимфомы).
3. Измерение широкого спектра цитокинов, продуцируемых и секретируемых MM и другими клетками в микроокружении BM: цитокины и хемокины, связанные с костью MM и микроокружением, будут измеряться в плазме BM и PB у пациентов в каждый момент времени. Лабораторные анализы будут проводиться с использованием набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
4. Биопсия костного мозга: биопсии костей пациентов с ММ на исходном уровне и после терапии моноклональными антителами (терапия мАт) будут оцениваться на предмет экспрессии супрессивных молекул, таких как маркер кластера дифференцировки 80/86 (CD80/86), маркер кластера дифференцировки 40 ( CD40) в опухолевых клетках и в лимфоидной популяции костного мозга методом иммуногистохимии.

Цель 3: После всесторонней характеристики геномных, транскриптомных и иммунофенотипических особенностей клеток CD138+ и получения четкой картины эффекторной/супрессивной иммунной популяции при ММ мы затем сопоставим эти характеристики с клиническими данными. Подробно мы создадим базу данных, включающую следующие столбцы:

• Исходные клинические характеристики
• Прогностические факторы: Международная система стадирования (ISS), пересмотренная международная система стадирования (R-ISS), лактатдегидрогеназа (ЛДГ), цитогенетический анализ с помощью флуоресцентного теста гибридизации in situ (FISH).
• Предшествующая терапия и соответствующие клинические результаты
• Лучший ответ: ответы будут определяться в соответствии с Международными едиными критериями ответа. Респонденты определяются как субъекты с как минимум VGPR.
• Данные о продолжительности ответа (DOR), выживаемости без прогрессирования (PFS), общей выживаемости (OS) и времени до прогрессирования (TTP). - внутренние и клеточные внешние признаки являются лучшими предикторами ответа. Из-за времени, необходимого для оценки ответа на заболевание, этот анализ будет проводиться по крайней мере через 1 год лечения или при более раннем прогрессировании. В первом анализе биологические особенности будут связаны с лучшим ответом на лечение, ВБП и другими исходными клиническими, прогностическими и терапевтическими переменными с использованием линейных моделей. Впоследствии, начиная с 3-го года, когда достаточное количество последующих наблюдений позволит провести значимый анализ ВБП и ОВ, модели Каплана-Мейера и Коксрегрессии будут приспособлены для выявления возможных независимых прогностических факторов.

Хотя относительно небольшой размер когорты ограничит статистическую мощность и возможность проведения анализа подгрупп, эта попытка идентифицировать биомаркеры может улучшить клиническое ведение пациента, отдав приоритет широкому спектру методов спасения при ММ и, таким образом, снизив затраты.