Determinantes genómicos y fenotípicos de la resistencia a inmunoterapias en mieloma múltiple

Objetivo 1: Evaluación de los mecanismos intrínsecos de la célula en BM.

1. La secuenciación del genoma completo (WGS) y la secuenciación del exoma completo (WES) se realizarán en células purificadas con marcador CD138+ para evaluar su perfil genómico y en muestras de ADN bucal para restringir el análisis a variantes o anomalías estructurales que tienen un estado somático claro y son por lo tanto específico para las células tumorales. En detalles:

   1.1 WGS: las bibliotecas se prepararán con el kit de preparación de bibliotecas sin reacción en cadena de la polimerasa de ADN (PCR) TruSeq™ (Kit Illumina) (Illumina, San Diego, CA) a partir de 500 ng de ADN genómico, con el objetivo de una inserción objetivo promedio de 300 pb. La secuenciación se realizará en un protocolo de extremo emparejado de 150 pb, a una profundidad objetivo de 40x para muestras tumorales y 30x para muestras normales.

   1.2 WES: las bibliotecas se prepararán con SureSelectXT Human All Exon V6 (Agilent technologies int., Santa Clara, CA) a partir de 100 ng de ADN genómico, con el objetivo de una inserción objetivo promedio de 300 pb. La secuenciación se realizará en un protocolo de extremos emparejados de 150 pb, con el objetivo de alcanzar una profundidad objetivo de 200x para muestras tumorales y 100x para muestras normales.

   1.3 Análisis de datos: los archivos de formato de salida del sistema de puntuación de secuenciación de próxima generación (archivos *.FASTQ) se alinearán con el genoma de referencia mediante la Herramienta de alineación Burrows-Wheeler (BWAmem), y los archivos de Mapa de alineación binaria (BAM) alineados y deduplicados se analizarán mediante el siguientes herramientas publicadas disponibles en el Wellcome Trust Sanger Institute (WTSI):

   1. número exacto de copias específicas de alelo en todo el genoma (ASCAT) y Battenberg para cambios en el número de copias clonales y subclonales.
   2. LATÓN para variaciones estructurales (grandes inversiones y deleciones, translocaciones, duplicación interna en tándem).
   3. Caveman y Pindel para variantes de nucleótido único (SNV) y pequeñas deleciones de inserción (indels).

   La composición clonal de la muestra y la evolución genómica del mieloma a lo largo del tiempo se inferirán a partir de la fracción de células cancerosas ajustada de las variantes identificadas, agrupadas y analizadas mediante un proceso bayesiano jerárquico de Dirichlet.

   Los procesos mutacionales operativos en varias fases de MM se analizarán utilizando un enfoque de factorización de matriz no negativa (NNMF) para extraer firmas mutacionales de la matriz de sustituciones en su contexto 5' y 3'.

   El posible papel de mutación conductora de todas las mutaciones sin sentido extraídas será evaluado por el algoritmo dN/dS publicado recientemente.

2. La secuenciación de ARN en células purificadas con marcador CD138+ para evaluar el perfil transcriptómico se realizará con el kit de preparación de bibliotecas de ácido ribonucleico (ARNm) de mensajero trenzado TruSeq (Illumina, San Diego, CA) en 500 ng de ARN total, seguido de la secuenciación, con el objetivo de obtener 100x106 lecturas totales por muestra. Se agregará una mezcla adicional de proteína de reparación de escisión de ADN (ERCC) para facilitar la normalización de los niveles de expresión entre muestras. Las lecturas se alinearán con Tophat2 para llamar a SNV, indels y detectar fusiones de genes. Cufflinks2 se utilizará para perfilar la expresión génica y detectar nuevas isoformas de transcripción. Los niveles generales de expresión de la transcripción de genes se cuantificarán utilizando la métrica de lecturas por millón de kilobases (RPKM) basada en lecturas de mapeo únicas.
3. Se realizará un análisis de citometría de flujo en muestras de MO para examinar los determinantes potenciales de la sensibilidad/resistencia a la inmunoterapia y la expresión de objetivos específicos, incluido el marcador Grupo de diferenciación 38 (CD38), el antígeno de maduración de células B (BCMA), el marcador Grupo de diferenciación 33 (CD33 ), ligando 1 de muerte programada (PDL1) y grupo de marcador de diferenciación 19 (CD19) antes del tratamiento, en la respuesta y en la recaída. Evaluaremos el porcentaje de células positivas para MM y la Intensidad Media de Fluorescencia (MFI) para monitorear la expresión del antígeno durante la evolución de la enfermedad. También se realizará la densidad del receptor. Además, el panel de enfermedad residual mínima (MRD) de MM del consorcio europeo cytoflow de la Fundación Internacional del Mieloma (EuroFlow-IMF) se aplicará para monitorear la MRD en particular mediante el uso de un antiCD38 multiepítopo (ME) para detectar posibles determinantes de resistencia. Además, este panel nos permitirá monitorear la evolución del fenotipo de la población clonal, observando en particular el cambio hacia células más inmaduras, lo que se ha sugerido como un mecanismo de resistencia a bortezomib.
4. Almacenamiento del marcador viable CD138-: evaluaremos la distribución del marcador CD38 también en las células del marcador CD138- y determinaremos si las lesiones genómicas o inmunofenotípicas responsables de la resistencia podrían estar presentes también en la fracción del marcador CD138-.

Objetivo 2: Evaluación del mecanismo extrínseco celular en BM y PB.

1. El análisis de citometría de flujo de las subpoblaciones de linfocitos se realizará en la misma MO y PB para evaluar la población de células T (marcador CD38+, marcador Grupo de diferenciación 4 (CD4+), marcador Grupo de diferenciación 8 (CD8+), células Treg) y otros reguladores y poblaciones inmunosupresoras como las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC). Las células T se medirán al inicio, en la respuesta y en la recaída, y podrían ayudar a evaluar la interacción entre los compartimentos de células B y T en pacientes que reciben inmunoterapias. Además, se realizará la evaluación de algunos puntos de control inmunitarios en las células T al inicio y después del tratamiento.
2. Se realizará la secuenciación de ARN de las subpoblaciones de linfocitos para identificar las frecuencias de las diversas poblaciones de linfocitos auxiliares y efectores, y correlacionarlas con la respuesta al tratamiento o la falta del mismo. También realizaremos RNA-seq en diferentes subpoblaciones de linfocitos T CD4+ marcadores en MM sensible y no sensible para identificar posibles firmas supresoras en el último grupo. Las mismas subpoblaciones de linfocitos se analizarán en muestras de MO de 10 sujetos sanos (biopsia de MO en estadificación negativa de linfoma).
3. Medición de un amplio espectro de citoquinas producidas y secretadas por MM y otras células dentro del microambiente de BM: las citoquinas y quimioquinas relacionadas con el hueso MM y el microambiente se medirán en plasma de BM y PB de pacientes en cada punto de tiempo. Los ensayos de laboratorio se realizarán utilizando un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
4. Biopsia de MO: las biopsias óseas de pacientes con MM al inicio y después de la terapia con anticuerpos monoclonales (terapia con mAb) se evaluarán para determinar la expresión de moléculas supresoras, como el marcador Grupo de diferenciación 80/86 (CD80/86), el marcador Grupo de diferenciación 40 ( CD40) en las células tumorales y en la población linfoide de MO por inmunohistoquímica.

Objetivo 3: Después de caracterizar exhaustivamente las características genómicas, transcriptómicas e inmunofenotípicas de las células CD138+, y tener una imagen clara de la población inmunitaria efectora/supresora en MM, correlacionaremos estas características con los datos clínicos. En detalle, crearemos una base de datos que incluya las siguientes columnas:

• Características clínicas basales
• Factores pronósticos: Sistema Internacional de Estadificación (ISS), Sistema Internacional de Estadificación Revisado (R-ISS), Lactato Deshidrogenasa (LDH), análisis citogenético por Fluorescencia In Situ Hybridization test (FISH)
• Terapias previas y resultados clínicos relevantes
• Mejor respuesta: las respuestas se definirán de acuerdo con los Criterios Internacionales de Respuesta Uniforme. Los respondedores se definen como sujetos con al menos un VGPR.
• Datos de duración de la respuesta (DOR), supervivencia libre de progresión (PFS), supervivencia general (OS) y tiempo de progresión (TTP) Con este objetivo, buscaremos la correlación entre las características biológicas y la respuesta a la enfermedad o la falta de ella, para comprender qué -Las características intrínsecas y extrínsecas de la célula son mejores predictores de la respuesta. Debido al tiempo necesario antes de que se pueda evaluar la respuesta de la enfermedad, este análisis se realizará después de al menos 1 año de tratamiento o en una progresión más temprana. En un primer análisis, las características biológicas se asociarán con la mejor respuesta al tratamiento, la SLP y otras variables clínicas, de pronóstico y de tratamiento basales utilizando modelos lineales. Posteriormente, a partir del año 3, cuando el seguimiento suficiente permita un análisis significativo de la SLP y la SG, se ajustarán los modelos de Kaplan-Meier y Coxregresión para identificar posibles factores pronósticos independientes.

Aunque el tamaño relativamente pequeño de la cohorte limitará el poder estadístico y la posibilidad de realizar análisis de subgrupos, este intento de identificar biomarcadores podría mejorar el manejo clínico del paciente, al priorizar la amplia gama de tratamientos de rescate en MM y, por lo tanto, disminuir los costos.