Genomische und phänotypische Determinanten der Resistenz gegen Immuntherapien beim Multiplen Myelom

Ziel 1: Evaluation zelleigener Mechanismen auf BM.

1. Whole Genome Sequencing (WGS) und Whole Exome Sequencing (WES) werden an Marker-CD138+-gereinigten Zellen durchgeführt, um ihr genomisches Profil zu bewerten, und an Wangenabstrich-DNA, um die Analyse auf Varianten oder strukturelle Anomalien zu beschränken, die einen klaren somatischen Status haben und sind daher spezifisch für die Tumorzellen. Im Detail:

   1.1 WGS: Bibliotheken werden mit dem TruSeq™ (Kit Illumina) DNA Polymerase Chain Reaction (PCR)-Free Library Preparation Kit (Illumina, San Diego, CA) aus 500 ng genomischer DNA hergestellt, wobei ein durchschnittliches Zielinsert von 300 bp angestrebt wird. Die Sequenzierung wird mit einem 150-bp-Paired-End-Protokoll bei einer Zieltiefe von 40x für Tumorproben und 30x für normale Proben durchgeführt.

   1.2 WES: Bibliotheken werden mit SureSelectXT Human All Exon V6 (Agilent Technologies Int., Santa Clara, CA) aus 100 ng genomischer DNA hergestellt, wobei ein durchschnittliches Target-Insert von 300 bp angestrebt wird. Die Sequenzierung wird mit einem 150-bp-Paired-End-Protokoll durchgeführt, wobei eine Zieltiefe von 200x für Tumorproben und 100x für normale Proben angestrebt wird.

   1.3 Datenanalyse: Dateien im Ausgabeformat des Next Generation Sequencing Scoring Systems (*.FASTQ-Dateien) werden mit dem Burrows-Wheeler Alignment Tool (BWAmem) mit dem Referenzgenom abgeglichen, und deduplizierte Alignment Binary Alignment Map (BAM)-Dateien werden mit analysiert folgenden veröffentlichten Tools, die beim Wellcome Trust Sanger Institute (WTSI) verfügbar sind:

   1. genaue genomweite allelspezifische Kopienzahl (ASCAT) und Battenberg für Änderungen der klonalen und subklonalen Kopienzahl.
   2. BRASS für strukturelle Variationen (große Inversionen und Deletionen, Translokationen, interne Tandemduplikation).
   3. Caveman und Pindel für Single Nucleotide Variants (SNVs) und kleine Insertions-Deletionen (Indels).

   Die klonale Zusammensetzung der Probe und die genomische Entwicklung des Myeloms im Laufe der Zeit werden aus der angepassten Krebszellfraktion der identifizierten, geclusterten und analysierten Varianten unter Verwendung eines hierarchischen bayesischen Dirichlet-Prozesses abgeleitet.

   Die Mutationsprozesse, die in verschiedenen Phasen von MM ablaufen, werden mit einem nicht-negativen Matrixfaktorisierungsansatz (NNMF) analysiert, um Mutationssignaturen aus der Reihe von Substitutionen in ihrem 5'- und 3'-Kontext zu extrahieren.

   Die mögliche Treiber-Mutationsrolle aller extrahierten Missense-Mutationen wird durch den kürzlich veröffentlichten dN/dS-Algorithmus bewertet.

2. RNA-seq auf mit Marker CD138+ gereinigten Zellen zur Bewertung des Transkriptomprofils wird mit dem TruSeq Stranded Messanger RiboNucleic Acid (mRNA) Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) mit 500 ng Gesamt-RNA durchgeführt, gefolgt von einer Sequenzierung mit dem Ziel von insgesamt 100 x 106 Reads pro Probe. DNA Excision Repair Protein (ERCC) Spike-in-Mix wird hinzugefügt, um die Normalisierung der Expressionsniveaus zwischen den Proben zu erleichtern. Reads werden mit Tophat2 ausgerichtet, um SNVs und Indels aufzurufen und Genfusionen zu erkennen. Manschettenknöpfe2 werden verwendet, um die Genexpression zu profilieren und neue Transkript-Isoformen zu erkennen. Das Gesamtexpressionsniveau des Gentranskripts wird mithilfe der Metrik „Reads Per Kilobase Million“ (RPKM) basierend auf eindeutigen Mapping-Reads quantifiziert.
3. An BM-Proben wird eine durchflusszytometrische Analyse durchgeführt, um potenzielle Determinanten der Immuntherapie-Empfindlichkeit/-Resistenz und die Expression spezifischer Ziele zu untersuchen, einschließlich Marker-Cluster der Differenzierung 38 (CD38), B-Zell-Reifungsantigen (BCMA), Marker-Cluster der Differenzierung 33 (CD33 ), programmierter Todesligand 1 (PDL1) und Marker Cluster of Differentiation 19 (CD19) vor der Behandlung, beim Ansprechen und beim Rückfall. Wir werden den MM-Prozentsatz positiver Zellen und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) auswerten, um die Antigenexpression während der Entwicklung der Krankheit zu überwachen. Die Rezeptordichte wird ebenfalls durchgeführt. Darüber hinaus wird das MM-Minimal-Residual-Disease (MRD)-Panel des europäischen Cytoflow-Konsortiums der International Myeloma Foundation (EuroFlow-IMF) zur Überwachung von MRD eingesetzt, insbesondere durch Verwendung eines Multiepitop (ME)-antiCD38, um mögliche Resistenzdeterminanten zu erkennen. Darüber hinaus wird uns dieses Panel ermöglichen, die Entwicklung des Phänotyps der klonalen Population zu überwachen, insbesondere die Verschiebung hin zu unreiferen Zellen, die als Mechanismus der Resistenz gegen Bortezomib vorgeschlagen wurde.
4. Speicherung des lebensfähigen Markers CD138-: Wir werden die Verteilung des Markers CD38 auch auf Marker-CD138-Zellen bewerten und feststellen, ob genomische oder immunphänotypische Läsionen, die für die Resistenz verantwortlich sind, auch in der Marker-CD138-Fraktion vorhanden sein könnten.

Ziel 2: Bewertung des zellextrinsischen Mechanismus auf BM und PB.

1. Die Durchflusszytometrie-Analyse von Lymphozyten-Subpopulationen wird im gleichen BM und PB durchgeführt, um die T-Zell-Population (Marker CD38+, Marker-Cluster der Differenzierung 4 (CD4+), Marker-Cluster der Differenzierung 8 (CD8+), Tregs-Zellen) und andere regulatorische und unterdrückende Immunpopulationen wie Myeloid-Derived Suppressor Cells (MDSCs). T-Zellen werden zu Studienbeginn, beim Ansprechen und beim Rückfall gemessen und könnten bei der Bewertung der Wechselwirkung zwischen B- und T-Zellkompartimenten bei Patienten helfen, die Immuntherapien erhalten. Darüber hinaus wird eine Bewertung einiger Immun-Checkpoints auf T-Zellen zu Studienbeginn und nach der Behandlung durchgeführt.
2. RNA-seq von Lymphozyten-Subpopulationen wird durchgeführt, um die Frequenzen der verschiedenen Helfer- und Effektor-Lymphozyten-Populationen zu identifizieren und diese mit dem Ansprechen auf die Behandlung oder deren Fehlen zu korrelieren. Wir werden auch RNA-seq an verschiedenen Marker-CD4+-T-Lymphozyten-Subpopulationen bei ansprechendem und nicht ansprechendem MM durchführen, um potenzielle unterdrückende Signaturen in der letzteren Gruppe zu identifizieren. Dieselben Lymphozyten-Subpopulationen werden in BM-Proben von 10 gesunden Probanden analysiert (BM-Biopsie bei Lymphom-negativem Staging).
3. Messung eines breiten Spektrums von Zytokinen, die von MM und anderen Zellen innerhalb der MM-Mikroumgebung produziert und sezerniert werden: Zytokine und Chemokine, die mit MM-Knochen und -Mikroumgebung in Zusammenhang stehen, werden zu jedem Zeitpunkt im BM- und PB-Plasma von Patienten gemessen. Die Laborassays werden mit einem ELISA-Kit (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) durchgeführt.
4. BM-Biopsie: Knochenbiopsien von MM-Patienten zu Studienbeginn und nach Therapie mit monoklonalen Antikörpern (mAbs-Therapie) werden auf die Expression von unterdrückenden Molekülen wie Marker Cluster of Differentiation 80/86 (CD80/86), Marker Cluster of Differentiation 40 ( CD40) in den Tumorzellen und in der BM-Lymphoidpopulation durch Immunhistochemie.

Ziel 3: Nachdem wir die genomischen, transkriptomischen und immunphänotypischen Merkmale von CD138+-Zellen umfassend charakterisiert haben und ein klares Bild der Effektor-/unterdrückenden Immunpopulation bei MM haben, werden wir diese Merkmale mit klinischen Daten korrelieren. Im Detail erstellen wir eine Datenbank mit folgenden Spalten:

• Klinische Grundmerkmale
• Prognosefaktoren: International Staging System (ISS), Revised International Staging System (R-ISS), Laktatdehydrogenase (LDH), zytogenetische Analyse durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstest (FISH)
• Frühere Therapien und relevante klinische Ergebnisse
• Beste Antwort: Die Antworten werden gemäß den International Uniform Response Criteria definiert. Responder sind als Probanden mit mindestens einem VGPR definiert.
• Daten zu Dauer des Ansprechens (DOR), progressionsfreiem Überleben (PFS), Gesamtüberleben (OS) und Zeit bis zur Progression (TTP) Zu diesem Zweck werden wir nach Korrelationen zwischen biologischen Merkmalen und Krankheitsreaktion oder deren Fehlen suchen, um zu verstehen, welche Zelle -Intrinsische und zellexterne Merkmale sind bessere Prädiktoren für die Reaktion. Aufgrund der Zeit, die benötigt wird, bevor das Ansprechen auf die Krankheit beurteilt werden kann, wird diese Analyse nach mindestens 1 Jahr Behandlung oder bei früherer Progression durchgeführt. In einer ersten Analyse werden biologische Merkmale mit dem besten Ansprechen auf die Behandlung, dem PFS und anderen klinischen, prognostischen und Behandlungsbasisvariablen unter Verwendung linearer Modelle in Verbindung gebracht. Anschließend, beginnend ab Jahr 3, wenn genügend Follow-up eine aussagekräftige Analyse von PFS und OS ermöglicht, werden Kaplan-Meier- und Coxregressionsmodelle angepasst, um mögliche unabhängige prognostische Faktoren zu identifizieren.

Obwohl die relativ geringe Größe der Kohorte die statistische Aussagekraft und die Möglichkeit zur Durchführung von Subgruppenanalysen einschränkt, könnte dieser Versuch, Biomarker zu identifizieren, das klinische Management des Patienten verbessern, indem die große Bandbreite an Salvage-Behandlungen bei MM priorisiert und somit die Kosten gesenkt werden.