Genomické a fenotypové determinanty rezistence na imunoterapii u mnohočetného myelomu

Cíl 1: Hodnocení buněčných vnitřních mechanismů na BM.

1. Sekvenování celého genomu (WGS) a sekvenování celého exomu (WES) bude provedeno na markerových CD138+ purifikovaných buňkách, aby se vyhodnotil jejich genomický profil, a na DNA bukálního výtěru, aby se omezila analýza na varianty nebo strukturální abnormality, které mají jasný somatický stav a jsou tedy specifické pro nádorové buňky. V detailech:

   1.1 WGS: knihovny budou připraveny pomocí soupravy TruSeq™ (Kit Illumina) bez polymerázové řetězové reakce DNA (PCR) pro přípravu knihovny (Illumina, San Diego, CA) z 500 ng genomové DNA, s cílem dosáhnout průměrného cílového insertu 300 bp. Sekvenování bude provedeno na 150bp-párovaném koncovém protokolu, v cílové hloubce 40x pro vzorky nádoru a 30x pro normální vzorky.

   1.2 WES: knihovny budou připraveny pomocí SureSelectXT Human All Exon V6 (Agilent technologies int., Santa Clara, CA) ze 100 ng genomové DNA, s cílem dosáhnout průměrného cílového insertu 300 bp. Sekvenování bude provedeno na 150bp spárovaném koncovém protokolu, jehož cílem je cílová hloubka 200x pro vzorky nádoru a 100x pro normální vzorky.

   1.3 Analýza dat: Soubory výstupního formátu sekvenačního skórovacího systému nové generace (soubory *.FASTQ) budou zarovnány s referenčním genomem pomocí nástroje Burrows-Wheeler Alignment Tool (BWAmem) a deduplikované zarovnané soubory binární mapy zarovnání (BAM) budou analyzovány pomocí následující publikované nástroje dostupné na Wellcome Trust Sanger Institute (WTSI):

   1. přesný počet alelově specifických kopií pro celý genom (ASCAT) a Battenberg pro změny počtu klonálních a subklonálních kopií.
   2. BRASS pro strukturální variace (velké inverze a delece, translokace, vnitřní tandemová duplikace).
   3. Caveman a Pindel pro jednotlivé nukleotidové varianty (SNV) a malé inzerce-delece (indely).

   Klonální složení vzorku a genomový vývoj myelomu v průběhu času budou odvozeny z upravené frakce rakovinných buněk variant identifikovaných, seskupených a analyzovaných pomocí hierarchického bayesiánského Dirichletova procesu.

   Mutační procesy fungující v různých fázích MM budou analyzovány pomocí přístupu Non-Negative Matrix Factorization (NNMF) pro extrakci mutačních signatur z řady substitucí v jejich 5' a 3' kontextu.

   Případná mutace ovladače všech extrahovaných mutací missense bude vyhodnocena nedávno publikovaným algoritmem dN/dS.

2. RNA-seq na markerových CD138+ purifikovaných buňkách k vyhodnocení transkriptomického profilu bude provedeno pomocí TruSeq Stranded Messanger RiboNucleic Acid (mRNA) Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) na 500 ng celkové RNA, následuje sekvenování s cílem 100x106 celkových čtení na vzorek. Pro usnadnění normalizace hladin exprese mezi vzorky bude přidána spike-in směs DNA excision repair protein (ERCC). Čtení budou zarovnána s Tophat2 pro volání SNV, indelů a detekci genových fúzí. Manžetové knoflíčky2 budou použity k profilování genové exprese a detekci nových transkriptových izoforem. Celkové hladiny exprese genového transkriptu budou kvantifikovány pomocí metriky Reads Per Kilobase Million (RPKM) založené na jedinečném mapování čtení.
3. Na vzorcích BM bude provedena analýza průtokovou cytometrií, aby se prozkoumaly potenciální determinanty citlivosti/rezistence na imunoterapii a exprese specifických cílů včetně markeru Cluster of Differentiation 38 (CD38), B-cell maturation antigen (BCMA), marker Cluster of Differentiation 33 (CD33 ), Ligand programované smrti 1 (PDL1) a markerový shluk diferenciace 19 (CD19) před léčbou, při odpovědi a při relapsu. Budeme hodnotit MM procento pozitivních buněk a střední fluorescenční intenzitu (MFI), abychom mohli monitorovat expresi antigenu během vývoje onemocnění. Bude také provedena hustota receptorů. Kromě toho bude evropské konsorcium pro cytoflow International Myeloma Foundation (EuroFlow-IMF) panel MM minimální reziduální nemoc (MRD) použito k monitorování MRD, zejména pomocí multiepitopu (ME) antiCD38 k detekci možných determinant rezistence. Tento panel nám navíc umožní sledovat vývoj fenotypu klonální populace, zejména se zaměřením na posun směrem k nezralejším buňkám, který byl navržen jako mechanismus rezistence vůči bortezomibu.
4. Skladování viabilního markeru CD138-: vyhodnotíme distribuci markeru CD38 také na markerových CD138- buňkách a určíme, zda by genomické nebo imunofenotypové léze odpovědné za rezistenci mohly být přítomny také ve frakci markeru CD138-.

Cíl 2: Zhodnocení buněčného vnějšího mechanismu na BM a PB.

1. Analýza průtokovou cytometrií subpopulací lymfocytů bude provedena ve stejné BM a PB k vyhodnocení populace T-buněk (marker CD38+, marker Cluster of Differentiation 4 (CD4+), marker Cluster of Differentiation 8 (CD8+), Tregs buňky) a další regulační a supresivní imunitní populace jako myeloidně odvozené supresorové buňky (MDSC). T lymfocyty budou měřeny na počátku, odezva a relaps a mohly by pomoci při hodnocení interakce mezi B a T lymfocytárními kompartmenty u pacientů, kteří dostávají imunoterapii. Kromě toho bude provedeno vyhodnocení některých imunitních kontrolních bodů na T buňkách na začátku a po léčbě.
2. RNA-seq subpopulací lymfocytů se provede za účelem identifikace frekvencí různých populací pomocných a efektorových lymfocytů a koreluje ty s odpovědí na léčbu nebo její nepřítomností. Provedeme také RNA-seq na různých markerových CD4+ T-lymfocytárních subpopulacích v responzivním a neresponzivním MM, abychom identifikovali potenciální supresivní signatury v druhé skupině. Stejné subpopulace lymfocytů budou analyzovány ve vzorcích BM od 10 zdravých subjektů (biopsie BM u lymfomu negativního stagingu).
3. Měření širokého spektra cytokinů produkovaných a vylučovaných MM a dalšími buňkami v mikroprostředí BM: cytokiny a chemokiny související s kostí a mikroprostředím MM budou měřeny v plazmě BM a PB od pacientů v každém časovém bodě. Laboratorní testy budou prováděny pomocí soupravy ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
4. Biopsie BM: kostní biopsie od pacientů s MM na začátku a po terapii monoklonálními protilátkami (terapie mAbs) budou hodnoceny na expresi supresivních molekul, jako je marker Cluster of Differentiation 80/86 (CD80/86), marker Cluster of Differentiation 40 ( CD40) v nádorových buňkách a v BM lymfoidní populaci imunohistochemicky.

Cíl 3: Poté, co komplexně charakterizujeme genomické, transkriptomické a imunofenotypové rysy CD138+ buněk a máme jasný obraz efektorové/supresivní imunitní populace u MM, budeme tyto rysy korelovat s klinickými daty. Podrobně vytvoříme databázi obsahující následující sloupce:

• Základní klinické charakteristiky
• Prognostické faktory: International Staging System (ISS), Revidovaný International Staging System (R-ISS), Laktátdehydrogenáza (LDH), cytogenetická analýza pomocí fluorescenčního in situ hybridizačního testu (FISH)
• Předchozí terapie a relevantní klinické výsledky
• Nejlepší reakce: odpovědi budou definovány podle mezinárodních kritérií jednotné reakce. Respondenti jsou definováni jako subjekty s alespoň VGPR.
• Údaje o trvání odpovědi (DOR), přežití bez progrese (PFS), celkovém přežití (OS) a době do progrese (TTP) V tomto cíli budeme hledat korelaci mezi biologickými rysy a odpovědí na onemocnění nebo jejich nedostatkem, abychom pochopili, která buňka -vnitřní a vnější buňky jsou lepšími prediktory odpovědi. Vzhledem k času potřebnému k posouzení odpovědi onemocnění bude tato analýza provedena po alespoň 1 roce léčby nebo při dřívější progresi. V první analýze budou biologické vlastnosti spojeny s nejlepší odpovědí na léčbu, PFS a dalšími základními klinickými, prognostickými a léčebnými proměnnými pomocí lineárních modelů. Následně, počínaje 3. rokem, kdy dostatečné sledování umožní smysluplnou analýzu PFS a OS, budou přizpůsobeny Kaplan-Meierovy a Coxregresní modely k identifikaci možných nezávislých prognostických faktorů.

Ačkoli relativně malá velikost kohorty omezí statistickou sílu a možnost provádět analýzu podskupin, tento pokus o identifikaci biomarkerů by mohl zlepšit klinickou péči o pacienta tím, že upřednostní širokou škálu záchranných léčebných postupů u MM, a tím sníží náklady.