Determinantes Genómicos e Fenotípicos da Resistência às Imunoterapias no Mieloma Múltiplo

Objetivo 1: Avaliação dos mecanismos intrínsecos da célula na MO.

1. O sequenciamento completo do genoma (WGS) e o sequenciamento completo do exoma (WES) serão realizados em células purificadas com marcador CD138+ para avaliar seu perfil genômico e em DNA de swab bucal para restringir a análise a variantes ou anormalidades estruturais que tenham um status somático claro e sejam portanto, específico para as células tumorais. Em detalhes:

   1.1 WGS: as bibliotecas serão preparadas com TruSeq™ (Kit Illumina) DNA Polymerase Chain Reaction (PCR)-Free Library Preparo Kit (Illumina, San Diego, CA) a partir de 500 ng de DNA genômico, visando uma inserção alvo média de 300bp. O sequenciamento será realizado em um protocolo final pareado de 150 pb, em uma profundidade alvo de 40x para amostras tumorais e 30x para amostras normais.

   1.2 WES: as bibliotecas serão preparadas com SureSelectXT Human All Exon V6 (Agilent technologies int., Santa Clara, CA) a partir de 100ng de DNA genômico, visando uma inserção alvo média de 300bp. O sequenciamento será realizado em um protocolo final pareado de 150 pb, objetivando uma profundidade alvo de 200x para amostras tumorais e 100x para amostras normais.

   1.3 Análise de dados: os arquivos de formato de saída do sistema de pontuação de sequenciamento de próxima geração (arquivos *.FASTQ) serão alinhados ao genoma de referência usando a Ferramenta de Alinhamento Burrows-Wheeler (BWAmem) e os arquivos de Mapa de Alinhamento Binário (BAM) alinhados desduplicados serão analisados ​​usando o seguintes ferramentas publicadas disponíveis no Wellcome Trust Sanger Institute (WTSI):

   1. número de cópias específicas de alelos em todo o genoma preciso (ASCAT) e Battenberg para alterações no número de cópias clonais e subclonais.
   2. BRASS para variações estruturais (grandes inversões e deleções, translocações, duplicação tandem interna).
   3. Caveman e Pindel para variantes de nucleotídeo único (SNVs) e pequenas inserções-deleções (indels).

   A composição clonal da amostra e a evolução genômica do mieloma ao longo do tempo serão inferidas a partir da fração ajustada de células cancerígenas das variantes identificadas, agrupadas e analisadas por meio de um processo bayesiano hierárquico de Dirichlet.

   Os processos mutacionais operativos em várias fases do MM serão analisados ​​usando uma abordagem de fatoração de matriz não negativa (NNMF) para extrair assinaturas mutacionais da matriz de substituições em seus contextos 5' e 3'.

   O possível papel da mutação do driver de todas as mutações missense extraídas será avaliado pelo algoritmo dN/dS publicado recentemente.

2. O RNA-seq nas células purificadas do marcador CD138+ para avaliar o perfil transcriptômico será realizado usando o TruSeq Stranded Messanger RiboNucleic Acid (mRNA) Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) em 500 ng de RNA total, seguido de sequenciamento, visando 100x106 leituras totais por amostra. A mistura de spike-in da proteína de reparo por excisão de DNA (ERCC) será adicionada para facilitar a normalização dos níveis de expressão entre as amostras. As leituras serão alinhadas com o Tophat2 para chamar SNVs, indels e detectar fusões de genes. Cufflinks2 será usado para perfilar a expressão gênica e detectar novas isoformas de transcrição. Os níveis gerais de expressão de transcrição gênica serão quantificados usando a métrica Reads Per Kilobase Million (RPKM) com base em leituras de mapeamento exclusivo.
3. A análise de citometria de fluxo será realizada em amostras de BM para examinar potenciais determinantes de sensibilidade/resistência à imunoterapia e a expressão de alvos específicos, incluindo marcador Cluster of Differentiation 38 (CD38), antígeno de maturação de células B (BCMA), marcador Cluster of Differentiation 33 (CD33 ), Ligante de morte programada 1 (PDL1) e marcador Cluster de Diferenciação 19 (CD19) antes do tratamento, na resposta e na recaída. Avaliaremos o percentual de MM de células positivas e a Intensidade Média de Fluorescência (MFI) para monitorar a expressão do antígeno durante a evolução da doença. A densidade do receptor também será realizada. Além disso, o consórcio europeu de citofluxo da International Myeloma Foundation (EuroFlow-IMF) MM painel de doença residual mínima (MRD) será aplicado para monitorar MRD em particular usando um antiCD38 multiepítopo (ME) para detectar possíveis determinantes de resistência. Além disso, este painel permitirá monitorar a evolução do fenótipo da população clonal, observando em particular a mudança para células mais imaturas, que tem sido sugerida como um mecanismo de resistência ao bortezomib.
4. Armazenamento do marcador viável CD138-: avaliaremos a distribuição do marcador CD38 também nas células do marcador CD138- e determinaremos se lesões genômicas ou imunofenotípicas responsáveis ​​pela resistência podem estar presentes também na fração do marcador CD138-.

Objetivo 2: Avaliação do mecanismo extrínseco celular em BM e PB.

1. A análise de citometria de fluxo de subpopulações de linfócitos será realizada na mesma MO e PB para avaliar a população de células T (marcador CD38+, marcador Cluster of Differentiation 4 (CD4+), marcador Cluster of Differentiation 8 (CD8+), células Tregs) e outras células reguladoras e populações imunológicas supressivas, como células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs). As células T serão medidas na linha de base, na resposta e na recaída, e podem ajudar na avaliação da interação entre os compartimentos das células B e T em pacientes recebendo imunoterapias. Além disso, será realizada a avaliação de alguns checkpoints imunológicos nas células T no início e no pós-tratamento.
2. O RNA-seq de subpopulações de linfócitos será realizado para identificar as frequências das várias populações de linfócitos auxiliares e efetores e correlacionar com a resposta ao tratamento ou a falta dela. Também realizaremos RNA-seq em diferentes subpopulações linfocíticas de CD4+ T em MM responsivo e não responsivo para identificar possíveis assinaturas supressivas no último grupo. As mesmas subpopulações de linfócitos serão analisadas em amostras de MO de 10 indivíduos saudáveis ​​(biópsia de MO em estadiamento negativo de linfoma).
3. Medição de um amplo espectro de citocinas produzidas e secretadas por MM e outras células dentro do microambiente BM: citocinas e quimiocinas relacionadas ao osso MM e microambiente serão medidas em plasma BM e PB de pacientes em cada ponto de tempo. Os ensaios laboratoriais serão realizados utilizando um kit de ensaio imunoenzimático (ELISA).
4. Biópsia de MO: biópsias ósseas de pacientes com MM no início e após a Terapia com Anticorpos Monoclonais (terapia com mAbs) serão avaliadas quanto à expressão de moléculas supressoras, como marcador Cluster of Differentiation 80/86 (CD80/86), marcador Cluster of Differentiation 40 ( CD40) nas células tumorais e na população linfoide da BM por imuno-histoquímica.

Objetivo 3: Depois de caracterizar de forma abrangente as características genômicas, transcriptômicas e imunofenotípicas das células CD138+, e ter uma imagem clara da população imune efetora/supressora no MM, correlacionaremos essas características com dados clínicos. Em detalhes, criaremos um banco de dados incluindo as seguintes colunas:

• Características clínicas basais
• Fatores prognósticos: International Staging System (ISS), Revised International Staging System (R-ISS), Lactato Desidrogenase (LDH), análise citogenética por Fluorescence In Situ Hybridization test (FISH)
• Terapias anteriores e resultados clínicos relevantes
• Melhor resposta: as respostas serão definidas de acordo com os Critérios de Resposta Uniforme Internacional. Respondedores são definidos como indivíduos com pelo menos um VGPR.
• Dados de Duração da Resposta (DOR), Sobrevivência Livre de Progressão (PFS), Sobrevida Global (OS) e Tempo de Progressão (TTP) As características intrínsecas e extrínsecas da célula são melhores preditores de resposta. Devido ao tempo necessário antes que a resposta da doença possa ser avaliada, esta análise será realizada após pelo menos 1 ano de tratamento ou na progressão anterior. Numa primeira análise, as características biológicas serão associadas à melhor resposta ao tratamento, PFS e outras variáveis ​​basais clínicas, prognósticas e de tratamento usando modelos lineares. Posteriormente, a partir do ano 3, quando acompanhamento suficiente permitirá uma análise significativa de PFS e OS, os modelos Kaplan-Meier e Coxregression serão ajustados para identificar possíveis fatores prognósticos independentes.

Embora o tamanho relativamente pequeno da coorte limite o poder estatístico e a possibilidade de realizar análises de subgrupos, essa tentativa de identificar biomarcadores pode melhorar o manejo clínico do paciente, priorizando a vasta gama de tratamentos de resgate em MM e, assim, diminuindo os custos.