Multippeli myelooman immunoterapiaresistenssin genomiset ja fenotyyppiset tekijät

Tavoite 1: Solujen sisäisten mekanismien arviointi BM:ssä.

1. Koko genomin sekvensointi (WGS) ja kokonaisen eksomin sekvensointi (WES) suoritetaan markkeri-CD138+-puhdistetuille soluille niiden genomiprofiilin arvioimiseksi ja bukkaaliselle vanupuikko-DNA:lle analyysin rajoittamiseksi muunnelmiin tai rakenteellisiin poikkeavuksiin, joilla on selkeä somaattinen tila ja jotka ovat siksi spesifisiä kasvainsoluille. Yksityiskohdissa:

   1.1 WGS: kirjastot valmistetaan TruSeq™(Kit Illumina) DNA Polymerase Chain Reaction (PCR) -Free Library Preparation Kit -sarjalla (Illumina, San Diego, CA) 500 ng:sta genomista DNA:ta, tavoitteena keskimääräinen 300 bp:n kohdeinsertti. Sekvensointi suoritetaan 150 bp:n paritetun pääteprotokollan mukaisesti, kohdesyvyydellä 40x kasvainnäytteille ja 30x normaaleille näytteille.

   1.2 WES: kirjastot valmistetaan SureSelectXT Human All Exon V6:lla (Agilent technology int., Santa Clara, CA) 100 ng:sta genomista DNA:ta, tavoitteena keskimääräinen 300 bp:n kohdeinsertti. Sekvensointi suoritetaan 150 bp:n paritetun pääteprotokollan mukaisesti, ja tavoitteena on 200-kertainen tavoitesyvyys kasvainnäytteille ja 100-kertainen normaaleille näytteille.

   1.3 Data-analyysi: seuraavan sukupolven sekvensointipisteytysjärjestelmän tulostusmuototiedostot (*.FASTQ-tiedostot) kohdistetaan referenssigenomiin Burrows-Wheeler Alignment Toolin (BWAmem) avulla, ja kopioidut kohdistetut Binary Alignment Map (BAM) -tiedostot analysoidaan käyttämällä seuraavat julkaistut työkalut, jotka ovat saatavilla Wellcome Trust Sanger Institutessa (WTSI):

   1. tarkka genominlaajuinen alleelispesifinen kopioluku (ASCAT) ja Battenberg klonaalisten ja subklonaalisten kopiolukujen muutoksille.
   2. BRASS rakenteellisiin muunnelmiin (suuret inversiot ja deleetiot, translokaatiot, sisäinen tandem-kaksoiskopiointi).
   3. Caveman ja Pindel yksittäisille nukleotidivarianteille (SNV) ja pienille insertiodeleetioille (indels).

   Näytteen klonaalinen koostumus ja myelooman genominen evoluutio ajan kuluessa päätellään tunnistettujen, ryhmitettyjen ja analysoitujen varianttien mukautetusta syöpäsolufraktiosta käyttämällä hierarkkista Bayesian Dirichlet-prosessia.

   Mutaatioprosessit, jotka toimivat MM:n eri vaiheissa, analysoidaan käyttämällä ei-negatiivista matriisitekijää (NNMF) -lähestymistapaa mutaatioiden allekirjoitusten erottamiseksi substituutioiden ryhmästä niiden 5'- ja 3'-kontekstissa.

   Äskettäin julkaistu dN/dS-algoritmi arvioi kaikkien erotettujen missense-mutaatioiden mahdollisen ajurimutaatioroolin.

2. RNA-sekvenssi markkeri CD138+ -puhdistetuilla soluilla transkriptomisen profiilin arvioimiseksi suoritetaan TruSeq Stranded Messsanger RiboNucleic Acid (mRNA) Library Prep Kit -pakkauksella (Illumina, San Diego, CA) 500 ng:lla kokonais-RNA:ta, mitä seuraa sekvensointi, tavoitteena 100 x 106 lukukertaa. näytettä kohti. DNA-leikkauskorjausproteiinin (ERCC) piikki-in-seos lisätään helpottamaan ekspressiotasojen normalisointia näytteiden välillä. Lukemat kohdistetaan Tophat2:n kanssa SNV:iden, indelien kutsumiseksi ja geenifuusioiden havaitsemiseksi. Kalvosinnapeita2 käytetään profiloimaan geeniekspressiota ja havaitsemaan uusia transkriptioisoformeja. Geenitranskriptin kokonaisilmentymistasot kvantifioidaan käyttämällä RPKM (Reads Per Kilobase Million) -metriikkaa, joka perustuu yksilöllisesti kartoittaviin lukuihin.
3. BM-näytteille suoritetaan virtaussytometria-analyysi, jotta voidaan tutkia mahdollisia immunoterapian herkkyyden/resistenssin määrääviä tekijöitä ja spesifisten kohteiden ilmentymistä, mukaan lukien markkeri Cluster of Differentiation 38 (CD38), B-solujen kypsymisantigeeni (BCMA), markkeri Cluster of Differentiation 33 (CD33). ), ohjelmoitu kuolema-ligandi 1 (PDL1) ja markkeri Cluster of Differentiation 19 (CD19) ennen hoitoa, vasteen ja uusiutumisen yhteydessä. Arvioimme MM-positiivisten solujen ja keskimääräisen fluoresenssivoimakkuuden (MFI) seurataksemme antigeenin ilmentymistä taudin evoluution aikana. Myös reseptoritiheys mitataan. Lisäksi kansainvälisen myeloomasäätiön (EuroFlow-IMF) MM:n (MRD) paneelin eurooppalaista sytoflow-konsortiota käytetään MRD:n seuraamiseen erityisesti käyttämällä multiepitooppia (ME) antiCD38:aa mahdollisten resistenssin determinanttien havaitsemiseen. Lisäksi tämä paneeli antaa meille mahdollisuuden seurata kloonipopulaation fenotyyppien kehitystä, tarkastelemalla erityisesti siirtymistä kohti kypsymättömiä soluja, joita on ehdotettu bortetsomibiresistenssin mekanismiksi.
4. Elinkykyisen markkerin CD138- varastointi: Arvioimme markkerin CD38 jakautumista myös markkeri CD138- soluissa ja selvitämme, voisiko resistenssistä vastuussa olevia genomisia tai immunofenotyyppisiä vaurioita esiintyä myös markkeri CD138-fraktiossa.

Tavoite 2: Solunulkoisen mekanismin arviointi BM:ssä ja PB:ssä.

1. Lymfosyyttialapopulaatioiden virtaussytometrinen analyysi suoritetaan samassa BM- ja PB-soluissa T-solupopulaation arvioimiseksi (markkeri CD38+, markkeri erilaistumisklusteri 4 (CD4+), markkeri erilaistumisklusteri 8 (CD8+), tregs-solut ja muut säätely- ja suppressiiviset immuunipopulaatiot, kuten myeloidista johdetut suppressorisolut (MDSC). T-solut mitataan lähtötilanteessa, vasteen ja uusiutumisen yhteydessä, ja ne voivat auttaa arvioimaan B- ja T-soluosastojen välistä vuorovaikutusta potilailla, jotka saavat immunoterapiaa. Lisäksi suoritetaan joidenkin T-solujen immuunijärjestelmän tarkistuspisteiden arviointi lähtötilanteessa ja hoidon jälkeen.
2. Lymfosyyttialapopulaatioiden RNA-seq suoritetaan eri auttaja- ja efektorilymfosyyttipopulaatioiden frekvenssien tunnistamiseksi ja niiden korreloimiseksi hoitovasteeseen tai sen puuttumiseen. Suoritamme myös RNA-seq:n erilaisille markkeri-CD4+ T-lymfosyyttisille alapopulaatioille herkässä ja ei-responsiivisessa MM:ssä tunnistaaksemme mahdolliset suppressiiviset allekirjoitukset jälkimmäisessä ryhmässä. Samat lymfosyyttialapopulaatiot analysoidaan 10 terveen henkilön BM-näytteissä (BM-biopsia lymfoomanegatiivisissa vaiheissa).
3. MM:n ja muiden BM-mikroympäristössä olevien solujen tuottamien ja erittämien sytokiinien laajan kirjon mittaus: MM-luuhun ja mikroympäristöön liittyvät sytokiinit ja kemokiinit mitataan potilaiden BM- ja PB-plasmassa kullakin aikapisteellä. Laboratoriomääritykset suoritetaan käyttämällä entsyymi-immunosorbenttimäärityssarjaa (ELISA).
4. BM-biopsia: MM-potilaiden luubiopsiat lähtötilanteessa ja monoklonaalisen vasta-ainehoidon (mAb-hoidon) jälkeen arvioidaan suppressoivien molekyylien, kuten markkeri Cluster of Differentiation 80/86 (CD80/86), markkeri Cluster of Differentiation 40 ( CD40) kasvainsoluissa ja BM-lymfoidipopulaatiossa immunohistokemiallisesti.

Tavoite 3: Kun CD138+-solujen genomiset, transkriptomiset ja immunofenotyyppiset piirteet on karakterisoitu kattavasti ja saatu selkeä kuva efektori/suppressiivisesta immuunipopulaatiosta MM:ssä, korreloimme nämä piirteet kliinisten tietojen kanssa. Luomme yksityiskohtaisesti tietokannan, joka sisältää seuraavat sarakkeet:

• Kliiniset perusominaisuudet
• Ennustetekijät: International Staging System (ISS), Revised International Staging System (R-ISS), Laktaattidehydrogenaasi (LDH), sytogeneettinen analyysi fluoresenssi In Situ -hybridisaatiotestillä (FISH)
• Aiemmat hoidot ja asiaankuuluvat kliiniset tulokset
• Paras vastaus: vastaukset määritellään kansainvälisten yhtenäisten vastauskriteerien mukaisesti. Vastaajat määritellään henkilöiksi, joilla on vähintään VGPR.
• Vasteen kesto (DOR), etenemisvapaa eloonjääminen (PFS), kokonaiseloonjääminen (OS) ja aika etenemiseen (TTP) Tässä tavoitteessa etsimme korrelaatiota biologisten ominaisuuksien ja taudin vasteen tai sen puutteen välillä ymmärtääksemme mikä solu - sisäiset ja solun ulkoiset ominaisuudet ennustavat paremmin vastetta. Koska taudin vasteen arvioimiseen tarvitaan aikaa, tämä analyysi tehdään vähintään vuoden hoidon jälkeen tai aikaisemmassa etenemisessä. Ensimmäisessä analyysissä biologiset ominaisuudet yhdistetään parhaaseen hoitovasteeseen, PFS:ään ja muihin perustason kliinisiin, prognostisiin ja hoitomuuttujiin käyttämällä lineaarisia malleja. Myöhemmin vuodesta 3 alkaen, kun riittävä seuranta mahdollistaa PFS:n ja OS:n tarkoituksenmukaisen analyysin, Kaplan-Meier- ja Coxregressiomallit sovitetaan mahdollisten riippumattomien prognostisten tekijöiden tunnistamiseksi.

Vaikka kohortin suhteellisen pieni koko rajoittaa tilastollista tehoa ja mahdollisuutta suorittaa alaryhmäanalyysiä, tämä yritys tunnistaa biomarkkereita voisi parantaa potilaan kliinistä hoitoa priorisoimalla laajan valikoiman pelastushoitoja MM:ssä ja siten alentamalla kustannuksia.