다발성 골수종에서 면역 요법에 대한 저항의 게놈 및 표현형 결정 요인

목표 1: BM에 대한 세포 고유 메커니즘의 평가.

1. WGS(Whole Genome Sequencing) 및 WES(Whole Exome Sequencing)는 마커 CD138+ 정제 세포에서 수행되어 게놈 프로필을 평가하고 구강 면봉 DNA에서 분석을 명확한 체세포 상태를 갖는 변이 또는 구조적 이상으로 제한하기 위해 수행되며 따라서 종양 세포에 특이적입니다. 세부 사항:

   1.1 WGS: 라이브러리는 TruSeq™(Kit Illumina) DNA Polymerase Chain Reaction (PCR)-Free Library Preparation Kit(Illumina, San Diego, CA)를 사용하여 게놈 DNA 500ng에서 평균 300bp의 표적 삽입을 목표로 준비됩니다. 시퀀싱은 종양 샘플의 경우 40x, 정상 샘플의 경우 30x의 표적 깊이에서 150bp-쌍 말단 프로토콜에서 수행됩니다.

   1.2 WES: 100ng의 게놈 DNA에서 SureSelectXT Human All Exon V6(Agilent technologies int., Santa Clara, CA)로 라이브러리를 준비하여 평균 300bp의 표적 삽입을 목표로 합니다. 시퀀싱은 종양 샘플의 경우 200x, 정상 샘플의 경우 100x의 목표 깊이를 목표로 150bp 쌍 말단 프로토콜에서 수행됩니다.

   1.3 데이터 분석: 차세대 시퀀싱 스코어링 시스템 출력 형식 파일(*.FASTQ 파일)은 BWAmem(Burrows-Wheeler Alignment Tool)을 사용하여 참조 게놈에 정렬되고, 중복 제거된 정렬된 BAM(Binary Alignment Map) 파일은 다음을 사용하여 분석됩니다. Wellcome Trust Sanger Institute(WTSI)에서 사용할 수 있는 게시된 도구는 다음과 같습니다.

   1. 정확한 ASCAT(genome-wide allele-specific copy number) 및 클론 및 서브클론 카피 수 변경을 위한 Battenberg.
   2. 구조적 변이에 대한 BRASS(큰 반전 및 삭제, 전좌, 내부 직렬 복제).
   3. SNV(Single Nucleotide Variants) 및 작은 삽입-결실(indel)에 대한 Caveman 및 Pindel.

   샘플의 클론 구성 및 시간 경과에 따른 골수종의 게놈 진화는 계층적 베이지안 디리클레 프로세스를 사용하여 식별, 클러스터링 및 분석된 변이체의 조정된 암세포 분획으로부터 추론될 것입니다.

   MM의 다양한 단계에서 작동하는 돌연변이 프로세스는 NNMF(Non-Negative Matrix Factorization) 접근 방식을 사용하여 분석하여 5' 및 3' 컨텍스트의 치환 배열에서 돌연변이 시그니처를 추출합니다.

   추출된 모든 미스센스 돌연변이의 가능한 드라이버 돌연변이 역할은 최근 발표된 dN/dS 알고리즘에 의해 평가될 것입니다.

2. 전사체 프로필을 평가하기 위해 마커 CD138+ 정제된 세포의 RNA-seq는 TruSeq Stranded Messanger RiboNucleic Acid(mRNA) Library Prep Kit(Illumina, San Diego, CA)를 사용하여 총 500ng RNA에 대해 시퀀싱을 수행한 후 100x106 총 판독을 목표로 합니다. 샘플당. 샘플 간 발현 수준의 정상화를 촉진하기 위해 DNA 절제 복구 단백질(ERCC) 스파이크인 믹스가 추가됩니다. 읽기는 Tophat2와 정렬되어 SNV, indel을 호출하고 유전자 융합을 감지합니다. Cufflinks2는 유전자 발현을 프로파일링하고 새로운 전사 동형체를 검출하는 데 사용됩니다. 전체 유전자 전사 발현 수준은 고유한 매핑 읽기를 기반으로 하는 RPKM(Reads Per Kilobase Million) 메트릭을 사용하여 정량화됩니다.
3. 유세포분석은 BM 샘플에 대해 수행되어 면역요법 감수성/내성의 잠재적 결정 요인과 마커 분화 클러스터 38(CD38), B 세포 성숙 항원(BCMA), 마커 분화 클러스터 33(CD33)을 포함한 특정 표적의 발현을 조사합니다. ), 프로그램화된 사멸-리간드 1(PDL1) 및 치료 전, 반응 및 재발 시 마커 분화 클러스터 19(CD19). 질병이 진행되는 동안 항원 발현을 모니터링하기 위해 MM 퍼센트 양성 세포와 평균 형광 강도(MFI)를 평가할 것입니다. 수용체 밀도도 수행됩니다. 또한 국제 골수종 재단(EuroFlow-IMF)의 유럽 세포 흐름 컨소시엄(MM MRD) 패널은 특히 다중 에피토프(ME) 항CD38을 사용하여 저항의 가능한 결정 요인을 감지함으로써 MRD를 모니터링하는 데 적용될 것입니다. 또한 이 패널을 통해 우리는 특히 보르테조밉에 대한 내성 메커니즘으로 제안된 보다 미성숙한 세포로의 이동을 살펴보면서 클론 집단의 표현형 진화를 모니터링할 수 있습니다.
4. 생존 가능한 마커 CD138-의 보관: 마커 CD138- 세포에서도 마커 CD38의 분포를 평가하고 내성을 담당하는 게놈 또는 면역 표현형 병변이 마커 CD138- 분획에도 존재할 수 있는지 결정할 것입니다.

목표 2: BM 및 PB에 대한 세포 외인성 메커니즘 평가.

1. T-세포 집단(마커 CD38+, 마커 분화 클러스터 4(CD4+), 마커 분화 클러스터 8(CD8+), Treg 세포) 및 기타 규제 및 MDSC(Myeloid-Derived Suppressor Cells)와 같은 억제 면역 인구. T 세포는 기준선, 반응 및 재발 시 측정되며 면역 요법을 받는 환자의 B 세포 구획과 T 세포 구획 사이의 상호 작용을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 기준선 및 치료 후 T 세포에 대한 일부 면역 체크포인트의 평가가 수행될 것입니다.
2. 림프구 아집단의 RNA-seq는 다양한 헬퍼 및 이펙터 림프구 집단의 빈도를 확인하고 이들을 치료에 대한 반응 또는 그것의 부족과 연관시키기 위해 수행될 것입니다. 우리는 또한 반응성 및 비반응성 MM에서 다른 마커 CD4+ T-림프구성 하위 집단에 대해 RNA-seq를 수행하여 후자 그룹에서 잠재적 억제 서명을 식별할 것입니다. 동일한 림프구 하위 집단이 10명의 건강한 피험자로부터의 BM 샘플에서 분석될 것입니다(림프종 음성 병기에서 BM 생검).
3. BM 미세환경 내에서 MM 및 기타 세포에 의해 생성되고 분비되는 광범위한 사이토카인 측정: MM 뼈 및 미세환경과 관련된 사이토카인 및 케모카인은 각 시점에서 환자의 BM 및 PB 혈장에서 측정됩니다. 실험실 분석은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트를 사용하여 수행됩니다.
4. BM 생검: 기준선 및 단일클론 항체 요법(mAbs 요법) 후 MM 환자의 뼈 생검은 마커 분화 클러스터 80/86(CD80/86), 마커 분화 클러스터 40( CD40) 면역조직화학에 의한 종양 세포 및 BM 림프계 집단에서.

목표 3: CD138+ 세포의 게놈, 전사체 및 면역 표현형 특징을 포괄적으로 특성화하고 MM에서 이펙터/억압 면역 집단에 대한 명확한 그림을 얻은 후 이러한 특징을 임상 데이터와 연관시킬 것입니다. 구체적으로 다음 열을 포함하는 데이터베이스를 생성합니다.

• 기본 임상 특성
• 예후 인자: International Staging System (ISS), Revised International Staging System (R-ISS), Lactate Dehydrogenase (LDH), Fluorescence In Situ Hybridization test (FISH)에 의한 세포유전학적 분석
• 이전 치료법 및 관련 임상 결과
• 최상의 응답: 응답은 International Uniform Response Criteria에 따라 정의됩니다. 응답자는 VGPR 이상이 있는 피험자로 정의됩니다.
• 반응 기간(DOR), 무진행 생존(PFS), 전체 생존(OS) 및 진행까지의 시간(TTP) 데이터 이 목적에서는 어떤 세포가 어떤 세포인지 이해하기 위해 생물학적 특징과 질병 반응 또는 그것의 부족 사이의 상관관계를 찾을 것입니다. -내재적 및 세포 외재적 특징은 반응을 더 잘 예측합니다. 질병 반응을 평가하기 전에 필요한 시간 때문에 이 분석은 최소 1년의 치료 후 또는 조기 진행에서 수행됩니다. 첫 번째 분석에서 생물학적 특징은 선형 모델을 사용하여 치료, PFS 및 기타 기본 임상, 예후 및 치료 변수에 대한 최상의 반응과 연관될 것입니다. 그 후, 충분한 후속 조치를 통해 PFS 및 OS에 대한 의미 있는 분석이 가능한 3년차부터 Kaplan-Meier 및 Coxregression 모델을 적용하여 가능한 독립적인 예후 인자를 식별할 것입니다.

코호트의 상대적으로 작은 크기는 통계적 능력과 하위 그룹 분석을 수행할 가능성을 제한하지만, 바이오마커를 식별하려는 이러한 시도는 MM에서 다양한 구제 치료의 우선 순위를 지정하여 비용을 줄임으로써 환자의 임상 관리를 개선할 수 있습니다.