Genomische en fenotypische determinanten van resistentie tegen immunotherapieën bij multipel myeloom

Doel 1: Evaluatie van cel-intrinsieke mechanismen op BM.

1. Whole Genome Sequencing (WGS) en Whole Exome Sequencing (WES) zullen worden uitgevoerd op met marker CD138+ gezuiverde cellen om hun genomisch profiel te evalueren, en op buccale uitstrijkjes om de analyse te beperken tot varianten of structurele afwijkingen met een duidelijke somatische status, en die dus specifiek voor de tumorcellen. In detail:

   1.1 WGS: bibliotheken zullen worden voorbereid met TruSeq™(Kit Illumina) DNA Polymerase Chain Reaction (PCR)-vrije bibliotheekvoorbereidingskit (Illumina, San Diego, CA) van 500 ng genomisch DNA, waarbij wordt gestreefd naar een gemiddelde doelinsertie van 300 bp. Sequentiebepaling zal worden uitgevoerd op een 150bp-gepaard eindprotocol, op een doeldiepte van 40x voor tumormonsters en 30x voor normale monsters.

   1.2 WES: bibliotheken zullen worden voorbereid met SureSelectXT Human All Exon V6 (Agilent technologies int., Santa Clara, CA) uit 100 ng genomisch DNA, waarbij wordt gestreefd naar een gemiddelde doelinsertie van 300 bp. Sequentiebepaling zal worden uitgevoerd op een 150bp-gepaard eindprotocol, waarbij wordt gestreefd naar een doeldiepte van 200x voor tumormonsters en 100x voor normale monsters.

   1.3 Gegevensanalyse: volgende generatie sequencing scoresysteem uitvoerformaatbestanden (*.FASTQ-bestanden) zullen worden uitgelijnd met het referentiegenoom met behulp van Burrows-Wheeler Alignment Tool (BWAmem), en gededupliceerde uitgelijnde Binary Alignment Map (BAM)-bestanden zullen worden geanalyseerd met behulp van de volgende gepubliceerde tools beschikbaar bij het Wellcome Trust Sanger Institute (WTSI):

   1. nauwkeurig genoombreed allelspecifiek kopienummer (ASCAT) en Battenberg voor wijzigingen in het aantal klonale en subklonale kopieën.
   2. MESSING voor structurele variaties (grote inversies en deleties, translocaties, interne tandemduplicatie).
   3. Caveman en Pindel voor Single Nucleotide Variants (SNV's) en kleine insertie-deleties (indels).

   De klonale samenstelling van het monster en de genomische evolutie van myeloom in de loop van de tijd zullen worden afgeleid uit de aangepaste kankercelfractie van de geïdentificeerde, geclusterde en geanalyseerde varianten met behulp van een hiërarchisch Bayesiaans Dirichlet-proces.

   De mutatieprocessen die werkzaam zijn in verschillende fasen van MM zullen worden geanalyseerd met behulp van een niet-negatieve matrixfactorisatie (NNMF)-benadering om mutatiesignaturen te extraheren uit de reeks substituties in hun 5'- en 3'-context.

   De mogelijke driver-mutatierol van alle geëxtraheerde missense-mutaties zal worden geëvalueerd door het recent gepubliceerde dN/dS-algoritme.

2. RNA-seq op marker CD138+ gezuiverde cellen om het transcriptomische profiel te evalueren zal worden uitgevoerd met behulp van TruSeq Stranded Messanger RiboNucleic Acid (mRNA) Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) op 500 ng totaal RNA, gevolgd door sequencing, gericht op 100x106 totale aflezingen per monster. DNA excision repair protein (ERCC) spike-in mix zal worden toegevoegd om normalisatie van de expressieniveaus tussen monsters te vergemakkelijken. Reads zullen worden uitgelijnd met Tophat2 om SNV's, indels en genfusies te detecteren. Manchetknopen2 zullen worden gebruikt om genexpressie te profileren en nieuwe isovormen van transcripten te detecteren. De algehele genexpressieniveaus zullen worden gekwantificeerd met behulp van de Reads Per Kilobase Million (RPKM)-metriek op basis van uniek in kaart gebrachte reads.
3. Flowcytometrie-analyse zal worden uitgevoerd op BM-monsters om mogelijke determinanten van immunotherapiegevoeligheid / -resistentie en de expressie van specifieke doelen te onderzoeken, waaronder marker Cluster of Differentiation 38 (CD38), B-cel rijpingsantigeen (BCMA), marker Cluster of Differentiation 33 (CD33 ), Programmed death-ligand 1 (PDL1) en marker Cluster of Differentiation 19 (CD19) voorafgaand aan de behandeling, bij respons en bij terugval. We zullen het MM-percentage positieve cellen en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) evalueren om de antigeenexpressie tijdens de evolutie van de ziekte te volgen. Receptordichtheid zal ook worden uitgevoerd. Bovendien zal het MM minimale residuele ziekte (MRD) panel van de International Myeloma Foundation (EuroFlow-IMF) het Europese cytoflow-consortium inzetten om MRD te monitoren, in het bijzonder door een multiepitopop (ME) anti-CD38 te gebruiken om mogelijke determinanten van resistentie te detecteren. Bovendien zal dit panel ons in staat stellen om de evolutie van het fenotype van de klonale populatie te volgen, waarbij we in het bijzonder kijken naar de verschuiving naar meer onrijpe cellen, waarvan is gesuggereerd dat het een resistentiemechanisme tegen bortezomib is.
4. Opslag van levensvatbare merker CD138-: we zullen de distributie van merker CD38 ook op merker CD138-cellen evalueren en we zullen bepalen of genomische of immunofenotypische laesies die verantwoordelijk zijn voor resistentie ook aanwezig kunnen zijn in de merker CD138-fractie.

Doel 2: Evaluatie van cel-extrinsiek mechanisme op BM en PB.

1. Flowcytometrie-analyse van lymfocytsubpopulaties zal worden uitgevoerd in dezelfde BM en PB om de T-celpopulatie te evalueren (marker CD38+, marker Cluster of Differentiation 4 (CD4+), marker Cluster of Differentiation 8 (CD8+), Tregs-cellen) en andere regulatoire en onderdrukkende immuunpopulaties zoals Myeloid-Derived Suppressor Cells (MDSC's). T-cellen zullen worden gemeten bij aanvang, respons en bij terugval, en ze kunnen helpen bij het evalueren van de interactie tussen B- en T-celcompartimenten bij patiënten die immunotherapie krijgen. Bovendien zullen enkele immuuncheckpoints op T-cellen bij aanvang en na de behandeling worden geëvalueerd.
2. RNA-seq van lymfocytsubpopulaties zal worden uitgevoerd om de frequenties van de verschillende helper- en effectorlymfocytpopulaties te identificeren en deze te correleren met respons op behandeling of het ontbreken daarvan. We zullen ook RNA-seq uitvoeren op verschillende marker CD4+ T-lymfocytische subpopulaties in responsieve en niet-responsieve MM om mogelijke onderdrukkende kenmerken in de laatste groep te identificeren. Dezelfde subpopulaties van lymfocyten zullen worden geanalyseerd in BM-monsters van 10 gezonde proefpersonen (BM-biopsie bij lymfoom-negatieve stadiëring).
3. Meting van een breed spectrum van cytokines geproduceerd en uitgescheiden door MM en andere cellen in de BM-micro-omgeving: cytokines en chemokinen gerelateerd aan MM-bot en micro-omgeving zullen op elk tijdstip worden gemeten in BM- en PB-plasma van patiënten. De laboratoriumtesten zullen worden uitgevoerd met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA)-kit.
4. BM-biopsie: botbiopten van MM-patiënten bij baseline en na monoklonale antilichaamtherapie (mAbs-therapie) zullen worden geëvalueerd op de expressie van onderdrukkende moleculen zoals marker Cluster of Differentiation 80/86 (CD80/86), marker Cluster of Differentiation 40 ( CD40) in de tumorcellen en in de BM-lymfoïde populatie door immunohistochemie.

Doel 3: Na een uitgebreide karakterisering van de genomische, transcriptomische en immunofenotypische kenmerken van CD138+-cellen en een duidelijk beeld te hebben van de effector/suppressieve immuunpopulatie in MM, zullen we deze kenmerken correleren met klinische gegevens. In detail zullen we een database maken met de volgende kolommen:

• Basislijn klinische kenmerken
• Prognostische factoren: International Staging System (ISS), Revised International Staging System (R-ISS), lactaatdehydrogenase (LDH), cytogenetische analyse door fluorescentie in situ hybridisatietest (FISH)
• Eerdere therapieën en relevante klinische resultaten
• Beste respons: reacties worden bepaald volgens de International Uniform Response Criteria. Responders worden gedefinieerd als proefpersonen met ten minste een VGPR.
• Duration of Response (DOR), Progression Free Survival (PFS), Overall survival (OS) en Time to Progression (TTP) gegevens In dit doel zullen we zoeken naar correlatie tussen biologische kenmerken en ziekterespons of het ontbreken daarvan, om te begrijpen welke cel -intrinsieke en cel-extrinsieke kenmerken zijn betere voorspellers van respons. Vanwege de tijd die nodig is voordat de ziekterespons kan worden beoordeeld, zal deze analyse worden uitgevoerd na ten minste 1 jaar behandeling of bij eerdere progressie. In een eerste analyse zullen biologische kenmerken worden geassocieerd met de beste respons op behandeling, PFS en andere basislijn klinische, prognostische en behandelingsvariabelen met behulp van lineaire modellen. Vervolgens, vanaf jaar 3, wanneer voldoende follow-up een zinvolle analyse van PFS en OS mogelijk maakt, zullen Kaplan-Meier- en Coxregressiemodellen worden aangepast om mogelijke onafhankelijke prognostische factoren te identificeren.

Hoewel de relatief kleine omvang van het cohort de statistische kracht en de mogelijkheid om subgroepanalyse uit te voeren zal beperken, zou deze poging om biomarkers te identificeren de klinische behandeling van de patiënt kunnen verbeteren door prioriteit te geven aan het brede scala aan bergingsbehandelingen in MM en zo de kosten te verlagen.