Genomiske og fænotypiske determinanter for resistens over for immunterapier ved myelomatose

Mål 1: Evaluering af celle-iboende mekanismer på BM.

1. Whole Genome Sequencing (WGS) og Whole Exome Sequencing (WES) vil blive udført på markør CD138+ oprensede celler for at evaluere deres genomiske profil og på bukkal podnings-DNA for at begrænse analysen til varianter eller strukturelle abnormiteter, der har en klar somatisk status og er derfor specifik for tumorcellerne. I detaljer:

   1.1 WGS: biblioteker vil blive forberedt med TruSeq™(Kit Illumina) DNA Polymerase Chain Reaction (PCR)-frit biblioteksforberedelseskit (Illumina, San Diego, CA) fra 500 ng genomisk DNA, med sigte på en gennemsnitlig målindsættelse på 300bp. Sekventering vil blive udført på en 150bp-parret endeprotokol ved en måldybde på 40x for tumorprøver og 30x for normale prøver.

   1.2 WES: biblioteker vil blive forberedt med SureSelectXT Human All Exon V6 (Agilent technologies int., Santa Clara, CA) fra 100 ng genomisk DNA, med sigte på en gennemsnitlig målindsættelse på 300 bp. Sekventering vil blive udført på en 150bp-parret slutprotokol, der sigter mod en måldybde på 200x for tumorprøver og 100x for normale prøver.

   1.3 Dataanalyse: Næste generations sekventeringsscoresystem-outputformatfiler (*.FASTQ-filer) vil blive justeret til referencegenomet ved hjælp af Burrows-Wheeler Alignment Tool (BWAmem), og deduplikerede justerede Binary Alignment Map-filer (BAM) vil blive analyseret ved hjælp af følgende offentliggjorte værktøjer tilgængelige på Wellcome Trust Sanger Institute (WTSI):

   1. nøjagtigt genomomfattende allelspecifikt kopinummer (ASCAT) og Battenberg for ændringer i klonale og subklonale kopital.
   2. MESSING til strukturelle variationer (store inversioner og deletioner, translokationer, intern tandemduplikation).
   3. Caveman og Pindel for Single Nucleotid Variants (SNV'er) og små insertionsdeletioner (indels).

   Den klonale sammensætning af prøven og den genomiske udvikling af myelom over tid vil blive udledt af den justerede cancercellefraktion af varianterne identificeret, grupperet og analyseret ved hjælp af en hierarkisk bayesiansk Dirichlet-proces.

   De mutationsprocesser, der virker i forskellige faser af MM, vil blive analyseret ved hjælp af en ikke-negativ matrixfaktorisering (NNMF) tilgang til at udtrække mutationssignaturer fra rækken af ​​substitutioner i deres 5'- og 3'-kontekst.

   Den mulige drivermutationsrolle for al ekstraheret missense-mutation vil blive evalueret af den nyligt offentliggjorte dN/dS-algoritme.

2. RNA-seq på markør CD138+ oprensede celler for at evaluere transkriptomisk profil vil blive udført ved hjælp af TruSeq Stranded Messanger RiboNucleic Acid (mRNA) Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) på 500 ng total RNA, efterfulgt af sekventering, sigter mod 100x106 i alt. pr prøve. DNA excision repair protein (ERCC) spike-in mix vil blive tilføjet for at lette normalisering af ekspressionsniveauerne mellem prøver. Aflæsninger vil blive justeret med Tophat2 for at kalde SNV'er, indels og detektere genfusioner. Manchetknapper2 vil blive brugt til at profilere genekspression og detektere nye transkriptisoformer. Overordnede gentransskriptionsekspressionsniveauer vil blive kvantificeret ved hjælp af Reads Per Kilobase Million (RPKM)-metrikken baseret på unikke kortlægningslæsninger.
3. Flowcytometrianalyse vil blive udført på BM-prøver for at undersøge potentielle determinanter for immunterapifølsomhed/-resistens og ekspressionen af ​​specifikke mål, herunder markør Cluster of Differentiation 38 (CD38), B-celle modningsantigen (BCMA), markør Cluster of Differentiation 33 (CD33) ), Programmeret dødsligand 1 (PDL1) og markør Cluster of Differentiation 19 (CD19) før behandling, ved respons og ved tilbagefald. Vi vil evaluere MM procent positive celler og Mean Fluorescence Intensity (MFI) for at overvåge antigenekspressionen under udviklingen af ​​sygdommen. Receptordensitet vil også blive udført. Desuden vil det europæiske cytoflow-konsortium af International Myeloma Foundation (EuroFlow-IMF) MM minimal residual disease (MRD) panel blive anvendt til at monitorere MRD, især ved at bruge en multiepitop (ME) antiCD38 til at påvise mulige resistensdeterminanter. Desuden vil dette panel give os mulighed for at overvåge fænotypeudviklingen af ​​den klonale population, idet vi især ser på skiftet mod mere umodne celler, hvilket er blevet foreslået som en mekanisme for resistens over for bortezomib.
4. Opbevaring af levedygtig markør CD138-: vi vil evaluere distribution af markør CD38 også på markør CD138-celler, og vi vil bestemme, om genomiske eller immunfænotypiske læsioner ansvarlige for resistens også kunne være til stede i markør CD138-fraktionen.

Mål 2: Evaluering af celleekstrinsisk mekanisme på BM og PB.

1. Flowcytometrianalyse af lymfocytunderpopulationer vil blive udført i den samme BM og PB for at evaluere T-cellepopulationen (markør CD38+, markør Cluster of Differentiation 4 (CD4+), markør Cluster of Differentiation 8 (CD8+), Tregs-celler) og andre regulatoriske og suppressive immunpopulationer som myeloid-afledte suppressorceller (MDSC'er). T-celler vil blive målt ved baseline, respons og ved tilbagefald, og de kan hjælpe med at evaluere interaktionen mellem B- og T-celle-rum hos patienter, der modtager immunterapi. Desuden vil der blive udført evaluering af nogle immunkontrolpunkter på T-celler ved baseline og efterbehandling.
2. RNA-seq af lymfocytsubpopulationer vil blive udført for at identificere frekvenserne af de forskellige hjælper- og effektorlymfocytpopulationer og korrelere dem med respons på behandling eller mangel på samme. Vi vil også udføre RNA-seq på forskellige markør CD4+ T-lymfocytiske subpopulationer i responsiv og ikke-responsiv MM for at identificere potentielle undertrykkende signaturer i sidstnævnte gruppe. De samme lymfocytsubpopulationer vil blive analyseret i BM-prøver fra 10 raske forsøgspersoner (BM-biopsi i lymfomnegativ stadieinddeling).
3. Måling af et bredt spektrum af cytokiner produceret og udskilt af MM og andre celler i BM mikromiljøet: cytokiner og kemokiner relateret til MM knogle og mikromiljø vil blive målt i BM og PB plasma fra patienter på hvert tidspunkt. Laboratorieanalyserne vil blive udført ved at bruge et enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.
4. BM-biopsi: knoglebiopsier fra MM-patienter ved baseline og efter monoklonal antistofterapi (mAbs-terapi) vil blive evalueret for ekspression af suppressive molekyler såsom markør Cluster of Differentiation 80/86 (CD80/86), markør Cluster of Differentiation 40 ( CD40) i tumorcellerne og i BM-lymfoidpopulationen ved immunhistokemi.

Mål 3: Efter omfattende karakterisering af de genomiske, transkriptomiske og immunfænotypiske træk ved CD138+ celler og efter at have et klart billede af effektor/suppressive immunpopulation i MM, vil vi derefter korrelere disse træk med kliniske data. I detaljer vil vi oprette en database med følgende kolonner:

• Baseline kliniske karakteristika
• Prognostiske faktorer: International Staging System (ISS), Revideret International Staging System (R-ISS), Lactat Dehydrogenase (LDH), cytogenetisk analyse ved Fluorescence In Situ Hybridization Test (FISH)
• Tidligere behandlinger og relevante kliniske resultater
• Bedste svar: svar vil blive defineret i henhold til International Uniform Response Criteria. Responders er defineret som forsøgspersoner med mindst en VGPR.
• Varighed af respons (DOR), Progressionsfri Overlevelse (PFS), Samlet overlevelse (OS) og Tid til Progression (TTP) data I dette mål vil vi se efter sammenhæng mellem biologiske egenskaber og sygdomsrespons eller mangel på samme for at forstå, hvilken celle -iboende og celleekstrinsiske træk er bedre forudsigere for respons. På grund af den nødvendige tid, før sygdomsrespons kan vurderes, vil denne analyse blive udført efter mindst 1 års behandling eller ved tidligere progression. I en første analyse vil biologiske træk være forbundet med bedste respons på behandling, PFS og andre baseline kliniske, prognostiske og behandlingsvariabler ved brug af lineære modeller. Efterfølgende, startende fra år 3, hvor tilstrækkelig opfølgning vil muliggøre en meningsfuld analyse af PFS og OS, vil Kaplan-Meier og Coxregression modeller blive tilpasset til at identificere mulige uafhængige prognostiske faktorer.

Selvom den relativt lille størrelse af kohorten vil begrænse statistisk magt og muligheden for at udføre subgruppeanalyse, kunne dette forsøg på at identificere biomarkører forbedre den kliniske håndtering af patienten ved at prioritere det store udvalg af redningsbehandlinger i MM og dermed reducere omkostningerne.