炎症と腸内微生物叢に対するアロニアの影響

人体測定学。 測定値は、検証済みのセグメント多周波生体電気インピーダンス分析 (SECA mBCA 515、ハンブルグ、ドイツ) を使用して参加者から収集されました。 脂肪量 (%) と推定内臓脂肪 (L) が分析に使用されました。

高脂肪食チャレンジ。 高脂肪の食事には、全粒粉トースト 3 枚 (127.5 g、小麦モンタナ) の上に有塩バター (58.3 g、ティラムック) が含まれていました。 食事の総エネルギー含有量は 714 kcal で、脂肪が 43.1% で、多量栄養素の内訳は脂肪 50 g、炭水化物 54 g、タンパク質 12 g でした。 食事と一緒に水が提供されました。習慣的なコーヒーの消費者であると特定された参加者には、代わりにカフェイン入りの紅茶が提供されました。

採血。 参加者は、来院前 24 時間は飲酒と激しい身体活動を避け、採血の 10 ～ 12 時間前に一晩絶食するように指示されました。 参加者の血液サンプルは、食事摂取前の朝と、食事摂取後 4 時間、合計 5 時点で毎時、資格のある看護師または医師によって採取されました。 血清分離チューブ内の全血を 15 分間凝固させた後、1200 RPM で 15 分間遠心分離し、得られた血清を分注し、分析まで -80ºC で保存しました。

血液マーカーの測定。 メタボリック シンドロームの血液マーカーは、Picollo Xpress Chemistry Analyzer 脂質パネル (Abaxis、Union City、USA) で実行された全血から決定されました。 血清インスリン (INS) は、インスリン ELISA キット (MP Biomedicals、オハイオ州ソロン) を使用して、製造元の指示に従って測定しました。 サイトカイン測定は、Millipore (EMD Millipore Corporation、Billerica、USA) による手順に従って、高感度多重化技術 (Bio-Rad Bio-Plex 200 HTS) を使用して実行されました。 古典的な全身性炎症誘発性サイトカインが測定され、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF)、インターロイキン (IL)-1B、IL-6、腫瘍壊死因子 (TNF)-α が含まれます。 インターロイキン I-17 と IL-23 も測定されました。どちらも腸粘膜で炎症促進および調節の役割を果たします。 高脂肪食チャレンジ中の各時点での血清サンプルを 2 回実行しました。

便サンプル コレクション。 採取キットが提供され、参加者は採血訪問の 24 時間前に便サンプルを自己採取するための同梱の指示に従うよう求められました。 滅菌済みの使い捨て便器に最初に収集した後、サンプルのごく一部を滅菌済みのエッペンドルフチューブに移し、研究者に輸送しました。 サンプルは、嫌気性チャンバー内で調製および分注し、分析まで -80ºC で凍結しました。

ゲノム DNA の抽出と微生物の分析。 Powersoil DNA Isolation Kit（Mo Bio Laboratories、Inc.）およびビーズビーティングを使用して、糞便サンプルからのバルクDNAの抽出を実行しました。 DNA は、16S rRNA V4 領域のイルミナ MiSeq アンプリコン配列決定のために、ミシガン州ミシガン州マイクロバイオーム プロジェクトのミシガン大学に一晩で発送されました。 DNA 定量化の後、V4 アンプリコン ライブラリーは、デュアル インデックス バーコード プライマーを使用して生成され、次にライブラリー精製、プール、および MiSeq ペアエンド シーケンスによって生成されました。 MOTHURソフトウェア（バージョン1.35.1）を使用して、生のシーケンスリードを処理およびキュレーションしました MiSeq プラットフォームの MOTHUR 標準操作手順に従います39。 簡単なレビューでは、ペアエンドリードを連続した配列に組み立て、長さと品質をスクリーニングしました。 残りのコンティグは、アラインされたrRNA配列の包括的なコレクションであるSILVAリボソームRNAデータベース（リリース132）にアラインされました。 MOTHUR の UCHIME アルゴリズムを使用して、潜在的にキメラな配列が特定され、削除されました。 分類学的分類は、リボソーム データベース プロジェクトのベイジアン分類子を使用して割り当てられました。 非ターゲット読み取りは削除され、操作上の分類単位 (OTU) は、97% の類似性しきい値で VSEARCH 距離ベースのクラスタリングを使用して割り当てられました。 アルファおよびベータ多様性指数は、R40 のビーガン パッケージを使用して生成されました。 ppTG表現型に含まれる参加者のために、OTUベースのデータマトリックスが構築されました。

メタボローム分析。 凍結血清サンプルを解凍し、20μLをきれいなチューブに入れた。 80μLのHPLCグレードのメタノールをサンプルに添加した後、簡単にボルテックスし、-80℃の冷凍庫に2時間入れました。 2時間後、サンプルを20,000gで10分間遠心分離した。 タンパク質ペレットを廃棄する間、代謝産物の上清を回収し、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃで濃縮乾固した。 次いで、試料をＬＣＭＳ分析の準備が整うまで−８０℃で保存し、その時点で４０μＬのメタノール：水（５０：５０）で再構成し、きれいな質量分析バイアルに入れた。 分析は、130A、1.7μm、2.1mm X 10mm Acquity BEH-HILIC HPLC カラムを使用して、Agilent 1290 UHPLC に結合された Agilent 6538 Q-TOF MS で完了しました。 サンプルはエレクトロスプレーイオン化によってイオン化され、実行はポジティブモードで完了しました。 移動相 A は 15mmol/L ギ酸アンモニウム、移動相 B は ACN で、6 分間で 10 ～ 40% のグラジエントを使用しました。 流量は 400 µL/分に維持し、カラム コンパートメント温度は 30 C に設定しました。MSMS 分析は、同じ LC 条件を使用して完了しましたが、以前の MS 実行からの保持時間と m/z 値を使用して特定のイオンをターゲットにしました。 LCMS 分析の完了後、生データ ファイルは .xml に変換されました MSConvert を使用したファイル。 次に、全イオンクロマトグラムの目視検査に基づいて強度最小値 1,000 を使用して mzMine でデータをマイニングし、ノイズを除去しました。 ブランクサンプルも実行し、ブランクと比較してサンプルに5:1未満の比率で存在する場合、結果の特徴は生物学的データから削除されました。 マイニングされたデータは、統計分析のために MetaboAnalyst に入力されました。 タンデム MS データを Sirius ソフトウェアで分析して、特徴を特定しました。