Impatti dell'aronia sull'infiammazione e sul microbioma intestinale

Antropometrici. Le misurazioni sono state raccolte dai partecipanti utilizzando l'analisi dell'impedenza bioelettrica multifrequenza segmentale convalidata (SECA mBCA 515, Amburgo, Germania). Per l'analisi sono stati utilizzati la massa grassa (%) e l'adiposo viscerale stimato (L).

Sfida del pasto ad alto contenuto di grassi. Il pasto ad alto contenuto di grassi conteneva burro salato (58,3 g, Tillamook) su 3 pezzi di pane tostato integrale (127,5 g; Wheat Montana). Il contenuto energetico totale del pasto era di 714 kcal, con il 43,1% di grassi, con una ripartizione dei macronutrienti di 50 g di grassi, 54 g di carboidrati e 12 g di proteine. L'acqua veniva fornita con il pasto; tè nero con caffeina è stato invece fornito ai partecipanti che si sono identificati come consumatori abituali di caffè.

Prelievo di sangue. I partecipanti sono stati istruiti a evitare il consumo di alcol e l'attività fisica faticosa nelle 24 ore precedenti la loro visita e a completare un digiuno notturno (10-12 ore) prima della raccolta del sangue. I campioni di sangue dei partecipanti sono stati raccolti da un infermiere o un medico certificato al mattino prima dell'ingestione del pasto e ogni ora per 4 ore dopo l'ingestione del pasto, per un totale di cinque punti temporali. Il sangue intero nelle provette per la separazione del siero è stato lasciato coagulare per 15 minuti prima della centrifugazione a 1200 RPM per 15 minuti con il siero risultante aliquotato e conservato a -80ºC fino all'analisi.

Determinazione dei marker ematici. I marcatori ematici della sindrome metabolica sono stati determinati dal sangue intero eseguito su pannelli lipidici Picollo Xpress Chemistry Analyzer (Abaxis, Union City, USA). L'insulina sierica (INS) è stata determinata utilizzando un kit ELISA per insulina (MP Biomedicals, Solon, OH) eseguito secondo le istruzioni del produttore. La misurazione delle citochine è stata eseguita utilizzando la tecnologia multiplexing ad alta sensibilità (Bio-Rad Bio-Plex 200 HTS) seguendo le procedure di Millipore (EMD Millipore Corporation, Billerica, USA). Sono state misurate le citochine pro-infiammatorie sistemiche classiche e includono il fattore stimolante le colonie di granulociti macrofagi (GM-CSF), l'interleuchina (IL)-1B, IL-6, il fattore di necrosi tumorale (TNF)-α. Sono state misurate anche interleuchina I-17 e IL-23, che svolgono entrambe un ruolo pro-infiammatorio e regolatore nella mucosa intestinale. I campioni di siero in ogni momento durante la sfida del pasto ad alto contenuto di grassi sono stati analizzati in duplicato.

Raccolta di campioni di feci. Sono stati forniti kit di raccolta e ai partecipanti è stato chiesto di seguire le istruzioni incluse per l'auto-raccolta di un campione di feci nelle 24 ore precedenti la visita di raccolta del sangue. Dopo la raccolta iniziale in una toilette monouso sterile, una piccola parte del campione è stata trasferita in una provetta Eppendorf sterile e trasportata ai ricercatori. I campioni sono stati preparati e aliquotati in una camera anaerobica, quindi congelati a -80ºC fino all'analisi.

Estrazione del DNA genomico e analisi microbica. L'estrazione del DNA sfuso dai campioni fecali è stata eseguita utilizzando il kit di isolamento del DNA Powersoil (Mo Bio Laboratories, Inc.) e il battito del tallone. Il DNA è stato spedito durante la notte all'Università del Michigan, Michigan Microbiome Project per il sequenziamento dell'amplicone Illumina MiSeq della regione 16S rRNA V4. Dopo la quantificazione del DNA, le librerie di ampliconi V4 sono state generate con primer con codice a barre a doppio indice, quindi mediante purificazione delle librerie, pooling e sequenziamento paired-end MiSeq. Le letture di sequenziamento non elaborate sono state elaborate e curate utilizzando il software MOTHUR (versione 1.35.1) seguendo la procedura operativa standard MOTHUR per la piattaforma MiSeq39. In breve rassegna, le letture paired-end sono state assemblate in sequenze contigue e vagliate per lunghezza e qualità. I contig rimanenti sono stati allineati al database dell'RNA ribosomiale SILVA (versione 132), una raccolta completa di sequenze di rRNA allineate. Sequenze potenzialmente chimeriche sono state identificate e rimosse utilizzando l'algoritmo UCHIME in MOTHUR. Le classificazioni tassonomiche sono state assegnate utilizzando il classificatore bayesiano del Ribosomal Database Project. Le letture non target sono state rimosse e le unità tassonomiche operative (OTU) sono state assegnate utilizzando il clustering basato sulla distanza VSEARCH alla soglia di somiglianza del 97%. Gli indici di diversità alfa e β sono stati generati utilizzando il pacchetto vegano in R40. È stata costruita una matrice di dati basata su OTU per i partecipanti inclusi nel fenotipo ppTG.

Analisi Metabolomica. I campioni di siero congelati sono stati scongelati e 20 μL sono stati posti in una provetta pulita. Al campione sono stati aggiunti 80 μL di metanolo di grado HPLC, dopodiché è stato agitato brevemente su vortex e posto in un congelatore a -80 C per 2 ore. Dopo due ore, il campione è stato centrifugato a 20.000 g per 10 minuti. Il supernatante del metabolita è stato raccolto e concentrato in uno Speed ​​Vac a secchezza mentre il pellet proteico è stato scartato. I campioni sono stati quindi conservati a -80 C fino al momento dell'analisi LCMS, momento in cui sono stati ricostituiti con 40 μL di metanolo: acqua (50:50) e collocati in una fiala pulita per spettrometria di massa. L'analisi è stata completata su un sistema MS Agilent 6538 Q-TOF accoppiato a un UHPLC Agilent 1290 utilizzando una colonna HPLC Acquity BEH-HILIC da 130 A, 1,7 μm, 2,1 mm x 10 mm. I campioni sono stati ionizzati tramite ionizzazione elettrospray e le corse sono state completate in modalità positiva. La fase mobile A era formiato di ammonio 15mmol/L e la fase mobile B era ACN utilizzando un gradiente A del 10-40% per 6 minuti. Il flusso è stato mantenuto a 400µL/minuto e la temperatura del compartimento della colonna è stata impostata a 30°C. L'analisi MSMS è stata completata utilizzando le stesse condizioni LC mirando a ioni specifici utilizzando il tempo di ritenzione e i valori m/z delle precedenti corse MS. Dopo il completamento dell'analisi LCMS, i file di dati grezzi sono stati convertiti in .xml file utilizzando MSConvert. I dati sono stati quindi estratti con mzMine utilizzando un valore minimo di intensità di 1.000 basato su un'ispezione visiva del cromatogramma ionico totale per rimuovere il rumore. Sono stati analizzati anche campioni in bianco e le caratteristiche risultanti sono state rimosse dai dati biologici se presenti in un rapporto inferiore a 5:1 nel campione rispetto al bianco. I dati estratti sono stati quindi inseriti in MetaboAnalyst per l'analisi statistica. I dati Tandem MS sono stati analizzati con il software Sirius per identificare le caratteristiche.