Effecten van Aronia op ontstekingen en het darmmicrobioom

Antropometrie. Metingen werden verzameld van deelnemers met behulp van de gevalideerde segmentale multifrequentie bio-elektrische impedantieanalyse (SECA mBCA 515, Hamburg, Duitsland). Vetmassa (%) en geschat visceraal vet (L) werden gebruikt voor analyse.

Vetrijke maaltijduitdaging. De vetrijke maaltijd bevatte gezouten boter (58,3 g, Tillamook) over 3 stukken volkoren toast (127,5 g; Wheat Montana). De totale energie-inhoud van de maaltijd was 714 kcal, waarvan 43,1% uit vet, met een afbraak van macronutriënten van 50 g vet, 54 g koolhydraten en 12 g eiwit. Bij de maaltijd werd water verstrekt; In plaats daarvan werd zwarte thee met cafeïne verstrekt aan deelnemers die zich identificeerden als gewone koffieconsumenten.

Bloedafname. Deelnemers werden geïnstrueerd om alcoholgebruik en zware fysieke activiteit te vermijden in de 24 uur voorafgaand aan hun bezoek en om 's nachts te vasten (10 - 12 uur) vóór bloedafname. Bloedmonsters van deelnemers werden 's ochtends vóór inname van de maaltijd verzameld door een gecertificeerde verpleegster of arts en elk uur gedurende 4 uur na inname van de maaltijd, in totaal vijf tijdspunten. Volbloed in serumscheidingsbuizen liet men gedurende 15 minuten stollen voordat het gedurende 15 minuten bij 1200 RPM werd gecentrifugeerd, waarbij het resulterende serum in porties werd verdeeld en tot analyse bij -80°C werd bewaard.

Bepaling van bloedmarkers. Bloedmarkers van het metabool syndroom werden bepaald uit volbloed op Picollo Xpress Chemistry Analyzer-lipidenpanelen (Abaxis, Union City, VS). Seruminsuline (INS) werd bepaald met behulp van een insuline-ELISA-kit (MP Biomedicals, Solon, OH) uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Cytokinemeting werd uitgevoerd met behulp van zeer gevoelige multiplextechnologie (Bio-Rad Bio-Plex 200 HTS) volgens procedures van Millipore (EMD Millipore Corporation, Billerica, VS). Klassieke systemische pro-inflammatoire cytokines werden gemeten en omvatten granulocyt-macrofaag-koloniestimulerende factor (GM-CSF), interleukine (IL)-1B, IL-6, tumornecrosefactor (TNF)-α. InterleukinI-17 en IL-23, die beide een pro-inflammatoire en regulerende rol spelen in het darmslijmvlies, werden ook gemeten. Serummonsters op elk tijdstip tijdens de vetrijke maaltijduitdaging werden in tweevoud uitgevoerd.

Krukmonsterverzameling. Er werden afnamekits verstrekt en de deelnemers werd gevraagd om de meegeleverde instructies te volgen voor het zelf afnemen van een ontlastingsmonster in de 24 uur voorafgaand aan hun bezoek aan de bloedafname. Na de eerste verzameling in een steriele wegwerpcommode, werd een klein deel van het monster overgebracht in een steriele Eppendorf-buis en getransporteerd naar onderzoekers. Monsters werden bereid en verdeeld in een anaerobe kamer en vervolgens ingevroren bij -80°C tot analyse.

Genomische DNA-extractie en microbiële analyse. Extractie van bulk-DNA uit fecale monsters werd uitgevoerd met behulp van Powersoil DNA Isolation Kit (Mo Bio Laboratories, Inc.) en parelkloppen. DNA werd 's nachts verzonden naar het Microbiome Project van de Universiteit van Michigan, Michigan voor Illumina MiSeq amplicon-sequencing van het 16S rRNA V4-gebied. Na DNA-kwantificatie werden V4-ampliconbibliotheken gegenereerd met dual-index barcoded-primers, vervolgens door bibliotheekzuivering, pooling en MiSeq-sequencing met gepaarde uiteinden. Raw sequencing reads werden verwerkt en samengesteld met behulp van MOTHUR-software (versie 1.35.1) volgens de MOTHUR-standaardwerkwijze voor het MiSeq-platform39. In een kort overzicht werden gepaarde eindaflezingen samengevoegd tot aaneengesloten reeksen en gescreend op lengte en kwaliteit. De resterende contigs werden uitgelijnd met de SILVA ribosomale RNA-database (release 132), een uitgebreide verzameling uitgelijnde rRNA-sequenties. Potentieel chimere sequenties werden geïdentificeerd en verwijderd met behulp van het UCHIME-algoritme in MOTHUR. Taxonomische classificaties werden toegewezen met behulp van de Bayesiaanse classificatie van het Ribosomal Database Project. Niet-doelaflezingen werden verwijderd en operationele taxonomische eenheden (OTU's) werden toegewezen met behulp van VSEARCH op afstand gebaseerde clustering bij de 97% gelijkheidsdrempel. Alfa- en β-diversiteitsindices werden gegenereerd met behulp van het veganistische pakket in R40. Er werd een op OTU gebaseerde datamatrix geconstrueerd voor deelnemers die deel uitmaakten van het ppTG-fenotype.

Metabolomische analyse. Bevroren serummonsters werden ontdooid en 20 μl werd in een schone buis geplaatst. 80 μL methanol van HPLC-kwaliteit werd aan het monster toegevoegd, waarna het kort werd gevortext en gedurende 2 uur in een vriezer van -80°C werd geplaatst. Na twee uur werd het monster gedurende 10 minuten bij 20.000 g gecentrifugeerd. Het supernatant van de metaboliet werd verzameld en geconcentreerd in een Speed ​​Vac tot droog, terwijl de eiwitpellet werd weggegooid. Monsters werden vervolgens bij -80 ° C bewaard totdat ze klaar waren voor LCMS-analyse, waarna ze werden gereconstitueerd met 40 μl methanol: water (50:50) en in een schoon massaspectrometrieflesje werden geplaatst. Analyse werd voltooid op een Agilent 6538 Q-TOF MS gekoppeld aan een Agilent 1290 UHPLC met behulp van een 130A, 1,7 μm, 2,1 mm x 10 mm Acquity BEH-HILIC HPLC-kolom. Monsters werden geïoniseerd via elektrospray-ionisatie en runs werden in positieve modus voltooid. Mobiele fase A was 15 mmol/L ammoniumformiaat en mobiele fase B was ACN met een gradiënt van 10-40% A gedurende 6 minuten. De stroom werd op 400 µl/minuut gehouden en de temperatuur van het kolomcompartiment werd ingesteld op 30°C. De MSMS-analyse werd voltooid onder dezelfde LC-omstandigheden, terwijl specifieke ionen werden getarget met behulp van retentietijd en m/z-waarden van eerdere MS-runs. Nadat de LCMS-analyse was voltooid, werden de onbewerkte gegevensbestanden geconverteerd naar .xml bestanden met behulp van MSConvert. Gegevens werden vervolgens gedolven met mzMine met een minimale intensiteitswaarde van 1.000 op basis van een visuele inspectie van het totale ionenchromatogram om ruis te verwijderen. Er werden ook blanco monsters genomen en de resulterende kenmerken werden verwijderd uit de biologische gegevens indien aanwezig in een verhouding van minder dan 5:1 in het monster in vergelijking met de blanco. De verzamelde gegevens werden vervolgens ingevoerd in MetaboAnalyst voor statistische analyse. Tandem MS-gegevens werden geanalyseerd met Sirius-software om kenmerken te identificeren.