Impactos de Aronia en la inflamación y el microbioma intestinal

Antropometría. Las mediciones se recopilaron de los participantes mediante el análisis de impedancia bioeléctrica multifrecuencia segmentaria validado (SECA mBCA 515, Hamburgo, Alemania). Para el análisis se utilizaron la masa grasa (%) y el tejido adiposo visceral estimado (L).

Desafío de comidas ricas en grasas. La comida rica en grasas contenía mantequilla salada (58,3 g, Tillamook) sobre 3 tostadas de trigo integral (127,5 g; Wheat Montana). El contenido energético total de la comida fue de 714 kcal, con un 43,1 % de grasa, con un desglose de macronutrientes de 50 g de grasa, 54 g de carbohidratos y 12 g de proteína. Se proporcionó agua con la comida; En cambio, se proporcionó té negro con cafeína a los participantes que se identificaron como consumidores habituales de café.

Muestra de sangre. Se instruyó a los participantes para que evitaran el consumo de alcohol y la actividad física extenuante en las 24 horas previas a su visita y que completaran un ayuno nocturno (10 a 12 horas) antes de la extracción de sangre. Las muestras de sangre de los participantes fueron recolectadas por una enfermera certificada o un médico en la mañana antes de la ingestión de la comida y cada hora durante 4 horas después de la ingestión de la comida, en total cinco puntos de tiempo. La sangre entera en tubos de separación de suero se dejó coagular durante 15 minutos antes de la centrifugación a 1200 RPM durante 15 minutos con el suero resultante dividido en alícuotas y almacenado a -80ºC hasta el análisis.

Determinación de marcadores sanguíneos. Los marcadores sanguíneos del síndrome metabólico se determinaron a partir de análisis de sangre total en paneles de lípidos del analizador químico Picollo Xpress (Abaxis, Union City, EE. UU.). La insulina sérica (INS) se determinó usando un kit ELISA de insulina (MP Biomedicals, Solon, OH) realizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La medición de citoquinas se realizó utilizando tecnología de multiplexación de alta sensibilidad (Bio-Rad Bio-Plex 200 HTS) siguiendo los procedimientos de Millipore (EMD Millipore Corporation, Billerica, EE. UU.). Se midieron las citocinas proinflamatorias sistémicas clásicas e incluyen el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), interleucina (IL)-1B, IL-6, factor de necrosis tumoral (TNF)-α. También se midieron la interleucina I-17 y la IL-23, que cumplen una función proinflamatoria y reguladora en la mucosa intestinal. Las muestras de suero en cada punto de tiempo durante el desafío de la comida rica en grasas se analizaron por duplicado.

Recolección de muestras de heces. Se proporcionaron kits de recolección y se les pidió a los participantes que siguieran las instrucciones incluidas para la auto-recolección de una muestra de heces en las 24 horas previas a su visita de recolección de sangre. Después de la recolección inicial en un inodoro desechable estéril, una pequeña porción de la muestra se transfirió a un tubo Eppendorf estéril y se transportó a los investigadores. Las muestras se prepararon y alicuotaron en una cámara anaerobia y luego se congelaron a -80ºC hasta su análisis.

Extracción de ADN genómico y análisis microbiano. La extracción de ADN a granel de muestras fecales se realizó utilizando el kit de aislamiento de ADN Powersoil (Mo Bio Laboratories, Inc.) y batido de perlas. El ADN se envió durante la noche a la Universidad de Michigan, Michigan Microbiome Project para la secuenciación de amplicones Illumina MiSeq de la región 16S rRNA V4. Después de la cuantificación del ADN, se generaron bibliotecas de amplicones V4 con cebadores de código de barras de índice dual, luego mediante la purificación de la biblioteca, la agrupación y la secuenciación de extremos emparejados de MiSeq. Las lecturas de secuenciación sin procesar se procesaron y seleccionaron con el software MOTHUR (versión 1.35.1) siguiendo el procedimiento operativo estándar MOTHUR para la plataforma MiSeq39. En una breve revisión, las lecturas de extremos emparejados se ensamblaron en secuencias contiguas y se examinaron en cuanto a longitud y calidad. Los contigs restantes se alinearon con la base de datos de ARN ribosomal SILVA (Versión 132), una colección completa de secuencias de ARNr alineadas. Las secuencias potencialmente quiméricas se identificaron y eliminaron utilizando el algoritmo UCHIME en MOTHUR. Las clasificaciones taxonómicas se asignaron utilizando el clasificador bayesiano del Ribosomal Database Project. Se eliminaron las lecturas no objetivo y se asignaron unidades taxonómicas operativas (OTU) mediante el agrupamiento basado en la distancia VSEARCH en el umbral de similitud del 97 %. Los índices de diversidad alfa y β se generaron utilizando el paquete vegano en R40. Se construyó una matriz de datos basada en OTU para los participantes incluidos en el fenotipo ppTG.

Análisis Metabolómico. Las muestras de suero congeladas se descongelaron y se colocaron 20 μl en un tubo limpio. Se añadieron 80 μl de metanol de grado HPLC a la muestra, después de lo cual se agitó brevemente y se colocó en un congelador a -80 °C durante 2 horas. Después de dos horas, la muestra se centrifugó a 20.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante del metabolito se recogió y se concentró en un Speed ​​Vac hasta sequedad mientras se desechaba el sedimento de proteína. A continuación, las muestras se almacenaron a -80 C hasta que estuvieran listas para el análisis LCMS, momento en el que se reconstituyeron con 40 μl de metanol:agua (50:50) y se colocaron en un vial de espectrometría de masas limpio. El análisis se completó en un Agilent 6538 Q-TOF MS acoplado a un Agilent 1290 UHPLC utilizando una columna de HPLC Acquity BEH-HILIC de 130A, 1,7 μm, 2,1 mm X 10 mm. Las muestras se ionizaron mediante ionización por electropulverización y las ejecuciones se completaron en modo positivo. La fase móvil A fue 15 mmol/L de formiato de amonio y la fase móvil B fue ACN utilizando un gradiente de A del 10-40 % durante 6 minutos. El flujo se mantuvo a 400 µL/minuto y la temperatura del compartimento de la columna se fijó en 30 C. El análisis de MSMS se completó usando las mismas condiciones de LC mientras se seleccionaban iones específicos usando el tiempo de retención y los valores m/z de las ejecuciones de MS anteriores. Después de completar el análisis LCMS, los archivos de datos sin procesar se convirtieron a .xml archivos usando MSConvert. Luego, los datos se extrajeron con mzMine utilizando un valor mínimo de intensidad de 1000 basado en una inspección visual del cromatograma de iones totales para eliminar el ruido. También se analizaron muestras en blanco y las características resultantes se eliminaron de los datos biológicos si estaban presentes en una proporción inferior a 5:1 en la muestra en comparación con el blanco. Luego, los datos extraídos se ingresaron en MetaboAnalyst para el análisis estadístico. Los datos de MS en tándem se analizaron con el software Sirius para identificar características.