Aronias indvirkning på inflammation og tarmmikrobiomet

Antropometri. Målinger blev indsamlet fra deltagere ved hjælp af den validerede segmentelle multifrekvens bioelektriske impedansanalyse (SECA mBCA 515, Hamborg, Tyskland). Fedtmasse (%) og estimeret visceral fedt (L) blev brugt til analyse.

Højfedt måltidsudfordring. Det fedtrige måltid indeholdt saltet smør (58,3 g, Tillamook) over 3 stykker fuldkornstoast (127,5 g; Wheat Montana). Måltidets samlede energiindhold var 714 kcal, med 43,1 % fra fedt, med en makronæringsstofnedbrydning på 50 g fedt, 54 g kulhydrat og 12 g protein. Vand blev leveret til måltidet; koffeinholdig sort te blev i stedet leveret til deltagere, der identificerede sig som sædvanlige kaffeforbrugere.

Blodprøvetagning. Deltagerne blev instrueret i at undgå alkoholforbrug og anstrengende fysisk aktivitet i de 24 timer før deres besøg og at gennemføre en faste natten over (10 - 12 timer) før blodprøvetagning. Deltagerblodprøver blev indsamlet af en certificeret sygeplejerske eller læge om morgenen før indtagelse af måltidet og hver time i 4 timer efter måltidsindtagelse, i alt fem tidspunkter. Fuldblod i serumsepareringsrør fik lov til at størkne i 15 minutter før centrifugering ved 1200 RPM i 15 minutter med resulterende serum i portioner og opbevaret ved -80ºC indtil analyse.

Bestemmelse af blodmarkører. Blodmarkører for metabolisk syndrom blev bestemt ud fra fuldblodsløb på Picollo Xpress Chemistry Analyzer lipidpaneler (Abaxis, Union City, USA). Seruminsulin (INS) blev bestemt under anvendelse af et insulin ELISA-kit (MP Biomedicals, Solon, OH) udført i henhold til producentens instruktioner. Cytokinmåling blev udført ved hjælp af højfølsom multipleksingsteknologi (Bio-Rad Bio-Plex 200 HTS) efter procedurer af Millipore (EMD Millipore Corporation, Billerica, USA). Klassiske systemiske pro-inflammatoriske cytokiner blev målt og inkluderer granulocyt makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF), interleukin (IL)-1B, IL-6, tumornekrosefaktor (TNF)-a. InterleukinI-17 og IL-23, som begge tjener en pro-inflammatorisk og regulerende rolle i tarmslimhinden, blev også målt. Serumprøver på hvert tidspunkt under måltidsudfordringen med højt fedtindhold blev kørt i to eksemplarer.

Samling af skammelprøver. Indsamlingssæt blev leveret, og deltagerne blev bedt om at følge de inkluderede instruktioner til selvindsamling af en afføringsprøve i 24 timer før deres blodopsamlingsbesøg. Efter den første indsamling i en steril engangskommode blev en lille del af prøven overført til et sterilt Eppendorf-rør og transporteret til forskere. Prøver blev forberedt og fordelt i et anaerobt kammer og derefter frosset ved -80ºC indtil analyse.

Genomisk DNA-ekstraktion og mikrobiel analyse. Ekstraktion af bulk-DNA fra fækale prøver blev udført under anvendelse af Powersoil DNA Isolation Kit (Mo Bio Laboratories, Inc.) og perleslåning. DNA blev sendt natten over til University of Michigan, Michigan Microbiome Project for Illumina MiSeq amplikonsekventering af 16S rRNA V4-regionen. Efter DNA-kvantificering blev V4-amplikonbiblioteker genereret med dual-index stregkodede primere, derefter ved biblioteksoprensning, pooling og MiSeq-parret ende-sekventering. Rå sekventeringslæsninger blev behandlet og kurateret ved hjælp af MOTHUR-software (version 1.35.1) ved at følge MOTHUR-standardproceduren for MiSeq-platformen39. I en kort gennemgang blev læsninger af parret ende samlet i sammenhængende sekvenser og screenet for længde og kvalitet. De resterende contigs blev justeret til SILVA ribosomale RNA-databasen (release 132), en omfattende samling af justerede rRNA-sekvenser. Potentielt kimære sekvenser blev identificeret og fjernet ved hjælp af UCHIME-algoritmen i MOTHUR. Taksonomiske klassifikationer blev tildelt ved hjælp af den Bayesianske klassificering af Ribosomal Database Project. Ikke-målaflæsninger blev fjernet, og operationelle taksonomiske enheder (OTU'er) blev tildelt ved hjælp af VSEARCH afstandsbaseret clustering ved 97% lighedstærsklen. Alfa- og β-diversitetsindekser blev genereret ved hjælp af den veganske pakke i R40. En OTU-baseret datamatrix blev konstrueret for deltagere inkluderet i ppTG-fænotypen.

Metabolomisk analyse. Frosne serumprøver blev optøet, og 20 μL blev anbragt i et rent rør. 80 μL methanol af HPLC-kvalitet blev tilsat til prøven, hvorefter den blev vortexet kort og anbragt i en -80 C fryser i 2 timer. Efter to timer blev prøven centrifugeret ved 20.000 g i 10 minutter. Metabolit-supernatanten blev opsamlet og koncentreret i en Speed ​​Vac til tørhed, mens proteinpelleten blev kasseret. Prøver blev derefter opbevaret ved -80 C, indtil de var klar til LCMS-analyse, på hvilket tidspunkt de blev rekonstitueret med 40 μL methanol:vand (50:50) og anbragt i et rent massespektrometrihætteglas. Analyse blev afsluttet på en Agilent 6538 Q-TOF MS koblet til en Agilent 1290 UHPLC under anvendelse af en 130A, 1,7 μm, 2,1 mm X 10 mm Acquity BEH-HILIC HPLC-søjle. Prøver blev ioniseret via elektrospray-ionisering, og kørsler blev afsluttet i positiv tilstand. Mobil fase A var 15 mmol/L ammoniumformiat og mobil fase B var ACN under anvendelse af en 10-40 % A-gradient over 6 minutter. Flow blev holdt på 400 µL/minut, og kolonnerummets temperatur blev indstillet til 30 C. MSMS-analyse blev afsluttet under anvendelse af de samme LC-betingelser, mens der blev målrettet mod specifikke ioner under anvendelse af retentionstid og m/z-værdier fra tidligere MS-kørsler. Efter afslutning af LCMS-analyse blev rådatafiler konverteret til .xml filer ved hjælp af MSConvert. Data blev derefter udvundet med mzMine under anvendelse af en intensitetsminimumsværdi på 1.000 baseret på en visuel inspektion af det samlede ionkromatogram for at fjerne støj. Blankprøver blev også kørt, og de resulterende træk blev fjernet fra de biologiske data, hvis de var til stede i et forhold under 5:1 i prøven sammenlignet med blindprøven. Minede data blev derefter indlæst i MetaboAnalyst til statistisk analyse. Tandem MS-data blev analyseret med Sirius-software for at identificere funktioner.