Virkninger av Aronia på betennelse og tarmmikrobiomet

Antropometri. Målinger ble samlet inn fra deltakere ved å bruke den validerte segmentelle multifrekvens bioelektriske impedansanalysen (SECA mBCA 515, Hamburg, Tyskland). Fettmasse (%) og estimert visceralt fett (L) ble brukt til analyse.

Høyfett måltidsutfordring. Det fettrike måltidet inneholdt saltet smør (58,3 g, Tillamook) over 3 stykker fullkorntoast (127,5 g; Wheat Montana). Totalt energiinnhold i måltidet var 714 kcal, med 43,1 % fra fett, med en nedbrytning av makronæringsstoffer på 50 g fett, 54 g karbohydrat og 12 g protein. Vann ble levert med måltidet; koffeinholdig svart te ble gitt i stedet for deltakere som identifiserte seg som vanlige kaffeforbrukere.

Blodprøvetaking. Deltakerne ble instruert om å unngå alkoholforbruk og anstrengende fysisk aktivitet i 24 timer før besøket og å fullføre en faste over natten (10 - 12 timer) før blodprøvetaking. Deltakerblodprøver ble tatt av en sertifisert sykepleier eller lege om morgenen før inntak av måltidet og hver time i 4 timer etter inntak av måltid, totalt fem tidspunkter. Fullblod i serumsepareringsrør ble tillatt å koagulere i 15 minutter før sentrifugering ved 1200 RPM i 15 minutter med resulterende serum i alikvoter og lagret ved -80ºC inntil analyse.

Bestemmelse av blodmarkører. Blodmarkører for metabolsk syndrom ble bestemt fra fullblod kjørt på Picollo Xpress Chemistry Analyzer lipidpaneler (Abaxis, Union City, USA). Seruminsulin (INS) ble bestemt ved å bruke et insulin ELISA-sett (MP Biomedicals, Solon, OH) utført i henhold til produsentens instruksjoner. Cytokinmåling ble utført ved bruk av høysensitiv multipleksingsteknologi (Bio-Rad Bio-Plex 200 HTS) etter prosedyrer av Millipore (EMD Millipore Corporation, Billerica, USA). Klassiske systemiske pro-inflammatoriske cytokiner ble målt og inkluderer granulocyttmakrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF), interleukin (IL)-1B, IL-6, tumornekrosefaktor (TNF)-α. InterleukinI-17 og IL-23, som begge tjener en pro-inflammatorisk og regulerende rolle i tarmslimhinnen, ble også målt. Serumprøver på hvert tidspunkt under måltidsutfordringen med høyt fett ble kjørt i duplikat.

Samling av avføringsprøver. Innsamlingssett ble levert og deltakerne ble bedt om å følge inkluderte instruksjoner for selvinnsamling av en avføringsprøve i løpet av 24 timer før blodprøvebesøket. Etter første samling i en steril engangskommode, ble en liten del av prøven overført til et sterilt Eppendorf-rør og transportert til forskere. Prøver ble preparert og alikvotert i et anaerobt kammer og deretter frosset ved -80ºC inntil analyse.

Genomisk DNA-ekstraksjon og mikrobiell analyse. Ekstraksjon av bulk-DNA fra fekale prøver ble utført ved bruk av Powersoil DNA Isolation Kit (Mo Bio Laboratories, Inc.) og perleslaging. DNA ble sendt over natten til University of Michigan, Michigan Microbiome Project for Illumina MiSeq amplikonsekvensering av 16S rRNA V4-regionen. Etter DNA-kvantifisering ble V4-amplikonbiblioteker generert med dual-index strekkodede primere, deretter ved bibliotekrensing, sammenslåing og MiSeq paret-ende-sekvensering. Råsekvenseringsavlesninger ble behandlet og kuratert ved bruk av MOTHUR-programvare (versjon 1.35.1) følge MOTHUR standard operasjonsprosedyre for MiSeq-plattformen39. I en kort gjennomgang ble avlesninger i par-ende satt sammen til sammenhengende sekvenser og screenet for lengde og kvalitet. De gjenværende contigs ble justert til SILVA ribosomale RNA-databasen (utgave 132), en omfattende samling av justerte rRNA-sekvenser. Potensielt kimære sekvenser ble identifisert og fjernet ved bruk av UCHIME-algoritmen i MOTHUR. Taksonomiske klassifiseringer ble tildelt ved å bruke den Bayesianske klassifiseringen til Ribosomal Database Project. Ikke-målavlesninger ble fjernet, og operasjonelle taksonomiske enheter (OTUs) ble tildelt ved bruk av VSEARCH avstandsbasert klynging ved 97% likhetsterskel. Alfa- og β-diversitetsindekser ble generert ved å bruke den veganske pakken i R40. En OTU-basert datamatrise ble konstruert for deltakere inkludert i ppTG-fenotypen.

Metabolomisk analyse. Frosne serumprøver ble tint og 20 μL ble plassert i et rent rør. 80 μL metanol av HPLC-kvalitet ble tilsatt prøven, hvoretter den ble vortexet kort og plassert i en -80 C fryser i 2 timer. Etter to timer ble prøven sentrifugert ved 20 000 g i 10 minutter. Metabolittsupernatanten ble samlet og konsentrert i en Speed ​​Vac til tørrhet mens proteinpelleten ble kastet. Prøver ble deretter lagret ved -80 C til de var klare for LCMS-analyse, da de ble rekonstituert med 40 μL metanol:vann (50:50) og plassert i et rent massespektrometriglass. Analysen ble fullført på en Agilent 6538 Q-TOF MS koblet til en Agilent 1290 UHPLC ved bruk av en 130A, 1,7 μm, 2,1 mm X 10 mm Acquity BEH-HILIC HPLC-kolonne. Prøver ble ionisert via elektrospray-ionisering og forsøk ble fullført i positiv modus. Mobil fase A var 15 mmol/L ammoniumformiat og mobil fase B var ACN ved bruk av en 10-40 % A-gradient over 6 minutter. Strømningen ble holdt på 400 µL/minutt og kolonnerommets temperatur ble satt til 30 C. MSMS-analyse ble fullført ved bruk av de samme LC-forholdene mens man målrettet mot spesifikke ioner ved bruk av retensjonstid og m/z-verdier fra tidligere MS-kjøringer. Etter at LCMS-analysen var fullført, ble rådatafiler konvertert til .xml filer ved hjelp av MSConvert. Data ble deretter utvunnet med mzMine ved å bruke en minimumsintensitetsverdi på 1000 basert på en visuell inspeksjon av det totale ionekromatogrammet for å fjerne støy. Blanke prøver ble også kjørt og de resulterende funksjonene ble fjernet fra de biologiske dataene hvis de var til stede i et forhold under 5:1 i prøven sammenlignet med blindprøven. Minedata ble deretter lagt inn i MetaboAnalyst for statistisk analyse. Tandem MS-data ble analysert med Sirius-programvare for å identifisere funksjoner.