Aronian vaikutukset tulehdukseen ja suoliston mikrobiomiin

Antropometriikka. Mittaukset kerättiin osallistujilta käyttämällä validoitua segmentaalista monitaajuista biosähköistä impedanssianalyysiä (SECA mBCA 515, Hampuri, Saksa). Analyysissä käytettiin rasvamassaa (%) ja arvioitua viskeraalista rasvaa (L).

Rasvaisen aterian haaste. Rasvainen ateria sisälsi suolatonta voita (58,3 g, Tillamook) kolmen täysjyväpaahtoleivän (127,5 g; Wheat Montana) päälle. Aterian kokonaisenergiapitoisuus oli 714 kcal, josta 43,1 % oli rasvaa, makroravinteiden jakautuessa 50 g rasvaa, 54 g hiilihydraattia ja 12 g proteiinia. Aterian mukana toimitettiin vettä; Kofeiinipitoista mustaa teetä tarjottiin sen sijaan osallistujille, jotka tunnistivat olevansa tavallisia kahvinkuluttajia.

Verinäytteenotto. Osallistujia opastettiin välttämään alkoholin käyttöä ja raskasta fyysistä aktiivisuutta 24 tuntia ennen vierailua ja suorittamaan yön yli paasto (10 - 12 tuntia) ennen verenottoa. Sertifioitu sairaanhoitaja tai lääkäri keräsi osallistujien verinäytteitä aamulla ennen aterian nauttimista ja tunnin välein 4 tunnin ajan aterian nauttimisen jälkeen, yhteensä viisi aikapistettä. Seerumin erotusputkissa olevan kokoveren annettiin hyytyä 15 minuuttia ennen sentrifugointia nopeudella 1200 RPM 15 minuuttia, jolloin saatu seerumi jaettiin eriin ja säilytettiin -80 ºC:ssa analyysiin asti.

Verimerkkiaineiden määritys. Metabolisen oireyhtymän verimarkkerit määritettiin kokoverestä, joka ajettiin Picollo Xpress Chemistry Analyzer -lipidipaneeleilla (Abaxis, Union City, USA). Seerumin insuliini (INS) määritettiin käyttämällä insuliini ELISA -pakkausta (MP Biomedicals, Solon, OH), joka suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sytokiinimittaus suoritettiin käyttämällä korkean herkkyyden multipleksointitekniikkaa (Bio-Rad Bio-Plex 200 HTS) Milliporen (EMD Millipore Corporation, Billerica, USA) menetelmiä noudattaen. Klassiset systeemiset pro-inflammatoriset sytokiinit mitattiin ja niihin sisältyivät granulosyyttimakrofagipesäkkeitä stimuloiva tekijä (GM-CSF), interleukiini (IL)-1B, IL-6, tuumorinekroositekijä (TNF)-a. Interleukiini I-17 ja IL-23, joilla molemmilla on tulehdusta edistävä ja säätelevä rooli suolen limakalvossa, mitattiin myös. Seeruminäytteet ajettiin kahtena rinnakkaisena kullakin aikapisteellä runsasrasvaisen aterian altistuksen aikana.

Jakkaranäytekokoelma. Keräyspakkaukset toimitettiin ja osallistujia pyydettiin noudattamaan mukana olevia ohjeita ulostenäytteen keräämiseksi itse 24 tuntia ennen verenottokäyntiään. Alkukeräyksen jälkeen steriiliin kertakäyttöiseen lipastoon pieni osa näytteestä siirrettiin steriiliin Eppendorf-putkeen ja kuljetettiin tutkijoille. Näytteet valmistettiin ja jaettiin eriin anaerobiseen kammioon ja jäädytettiin -80 ºC:ssa analyysiin asti.

Genomisen DNA:n uuttaminen ja mikrobianalyysi. Bulkki-DNA:n uuttaminen ulostenäytteistä suoritettiin käyttämällä Powersoil DNA Isolation Kit -pakkausta (Mo Bio Laboratories, Inc.) ja helmiä jauhamista. DNA lähetettiin yön yli Michiganin yliopistoon, Michigan Microbiome -projektiin Illumina MiSeq -amplikonin sekvensointia varten 16S rRNA V4 -alueella. DNA-kvantifioinnin jälkeen V4-amplikonikirjastot luotiin kaksoisindeksillä viivakoodatuilla alukkeilla, sitten kirjaston puhdistamisella, yhdistämisellä ja MiSeq-paripään sekvensoinnilla. Sekvensoinnin raakalukemat käsiteltiin ja kuratoitiin MOTHUR-ohjelmistolla (versio 1.35.1). noudattamalla MOTHUR-standardin mukaista toimintamenettelyä MiSeq-alustalle39. Lyhyessä katsauksessa paripään lukemat koottiin vierekkäisiksi sekvensseiksi ja seulottiin pituuden ja laadun suhteen. Loput jatkumot rinnastettiin SILVA-ribosomaalisen RNA-tietokantaan (julkaisu 132), joka on kattava kokoelma kohdistettuja rRNA-sekvenssejä. Mahdollisesti kimeeriset sekvenssit tunnistettiin ja poistettiin käyttämällä UCHIME-algoritmia MOTHURissa. Taksonomiset luokitukset määritettiin käyttämällä Ribosomal Database Projectin Bayes-luokittajaa. Muut kuin kohdelukemat poistettiin ja operatiiviset taksonomiset yksiköt (OTU) määritettiin käyttämällä VSEARCH-etäisyyspohjaista klusterointia 97 %:n samankaltaisuuskynnyksellä. Alfa- ja β-diversiteettiindeksit luotiin käyttämällä vegaanipakettia R40:ssä. OTU-pohjainen datamatriisi rakennettiin ppTG-fenotyyppiin kuuluville osallistujille.

Metabolinen analyysi. Pakastetut seeruminäytteet sulatettiin ja 20 µl laitettiin puhtaaseen putkeen. 80 µl HPLC-laatuista metanolia lisättiin näytteeseen, minkä jälkeen sitä vorteksoitiin lyhyesti ja laitettiin -80 C pakastimeen 2 tunniksi. Kahden tunnin kuluttua näytettä sentrifugoitiin 20 000 g:ssä 10 minuuttia. Metaboliittisupernatantti kerättiin ja konsentroitiin Speed ​​Vac -laitteessa kuiviin samalla kun proteiinipelletti heitettiin pois. Näytteitä säilytettiin sitten -80 C:ssa, kunnes ne olivat valmiita LCMS-analyysiin, jolloin ne liuotettiin 40 µl:lla metanoli:vesi-seosta (50:50) ja asetettiin puhtaaseen massaspektrometriapulloon. Analyysi suoritettiin Agilent 6538 Q-TOF MS:llä, joka oli kytketty Agilent 1290 UHPLC:hen käyttämällä 130A, 1,7 μm, 2,1 mm X 10 mm Acquity BEH-HILIC HPLC-kolonnia. Näytteet ionisoitiin sähkösumutusionisaatiolla ja ajot suoritettiin positiivisessa tilassa. Liikkuva faasi A oli 15 mmol/l ammoniumformiaattia ja liikkuva faasi B oli ACN käyttäen 10-40 % A:n gradienttia 6 minuutin aikana. Virtaus pidettiin 400 ul/minuutissa ja kolonniosaston lämpötila asetettiin 30 °C:seen. MSMS-analyysi suoritettiin käyttäen samoja LC-olosuhteita samalla kun kohdistettiin spesifisiä ioneja käyttämällä retentioaikaa ja m/z-arvoja aiemmista MS-ajoista. LCMS-analyysin valmistuttua raakadatatiedostot muunnettiin .xml-muotoon tiedostot MSConvertilla. Tiedot louhittiin sitten mzMinellä käyttämällä intensiteetin minimiarvoa 1 000 perustuen kokonaisionikromatogrammin visuaaliseen tarkasteluun kohinan poistamiseksi. Myös tyhjiä näytteitä ajettiin ja tuloksena saadut piirteet poistettiin biologisista tiedoista, jos niitä oli suhteessa alle 5:1 näytteessä verrattuna nollanäytteeseen. Louhitut tiedot syötettiin sitten MetaboAnalystiin tilastollista analyysiä varten. Tandem MS -tiedot analysoitiin Sirius-ohjelmistolla ominaisuuksien tunnistamiseksi.